安　瑜，王慧芳，張敏娟，唐　欣，李　曉，蘇京晶

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安　710048）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測液態(tài)乳及原料乳中舒巴坦

安瑜，王慧芳，張敏娟，唐欣，李曉，蘇京晶

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安710048）

建立液態(tài)乳及原料乳中舒巴坦殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法。樣品經(jīng)溶劑提取凈化后，采用Poroshell 120SB-C18型液相色譜柱分離，以水和甲醇為流動相，進(jìn)行等度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，舒巴坦測定方法檢出限為0.5 μg/kg，線性范圍內(nèi)低、中、高3個(gè)添加水平的回收率為81.8%～87.8%，精密度為3.3%～4.4%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于液態(tài)乳及原料乳中舒巴坦的檢測。

舒巴坦；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；液態(tài)乳；原料乳；檢測

畜牧養(yǎng)殖過程中，為了給牲畜防病、防疫會普遍使用抗生素，但是抗生素使用中不規(guī)范、濫用的情況較為普遍，導(dǎo)致生鮮乳中抗生素殘留超標(biāo)。人長期食用超過安全限量抗生素的乳制品可產(chǎn)生耐藥性，造成人體腸道菌群紊亂，對易感人群更容易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，從而對人身體健康帶來危害。生鮮乳抗生素殘留一直是乳制品質(zhì)量安全監(jiān)管的重點(diǎn)，為了分解生鮮乳中殘留的抗生素以逃避監(jiān)管，市場上出現(xiàn)了在生鮮乳中添加以β-內(nèi)酰胺酶為主要成分的抗生素分解劑。衛(wèi)生部在《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第2批）》中明確將β-內(nèi)酰胺酶列入非食用物質(zhì)禁止在食品中添加，但目前又出現(xiàn)了添加舒巴坦來抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的問題。舒巴坦作為一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，一方面會干擾對β-內(nèi)酰胺酶的檢測；另一方面人為添加的舒巴坦殘留在乳制品中，會對人身體健康帶來危害。目前，還沒有標(biāo)準(zhǔn)方法對原料乳及液態(tài)乳中舒巴坦殘留量進(jìn)行檢測。

目前，國內(nèi)外有關(guān)舒巴坦的檢測方法主要包括高效液相色譜法［1］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［2-5］，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。高效液相色譜法測定方法簡單，易于操作，可以較好地對舒巴坦含量進(jìn)行定量測定，但其僅通過保留時(shí)間進(jìn)行定性，易出現(xiàn)假陽性。而使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法時(shí)，樣品前處理需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，操作復(fù)雜，回收率低。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法操作簡便、靈敏度高、回收率和重復(fù)性良好，可以較好的對舒巴坦進(jìn)行定性和定量分析，適用于原料乳及液態(tài)奶中舒巴坦藥物殘留的測定。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

純牛奶，內(nèi)蒙古伊利集團(tuán)產(chǎn)品；調(diào)制乳，陜西銀橋集團(tuán)產(chǎn)品；原料乳，陜西百躍集團(tuán)產(chǎn)品。

舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），德國Dr.ehrenstor-fer gmbh公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純），德國默克公司產(chǎn)品。

6420 Triple Quad LC/MS型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、Poroshell 120SB-C18型色譜柱，美國Agilent公司產(chǎn)品；UHP-Ⅲ-20T型超純水機(jī)，成都優(yōu)越科技有限公司產(chǎn)品；BSA224S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5.0 g（精確到0.01 g） 于50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，加入20 mL甲醇，振蕩提取20 min，于轉(zhuǎn)速6 500 r/min下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，在50℃下旋轉(zhuǎn)至干，加入1 mL水溶解，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，于轉(zhuǎn)速15 000 r/min下離心5 min，上清液過0.2 μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.2色譜條件

色譜柱：Poroshell120SB-C18型，3.0mm×100mm× 2.7 μm，或性能相當(dāng)者；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5 μL；流動相為水∶甲醇=90∶10，等度洗脫；流速為0.3 mL/min。

1.2.3質(zhì)譜條件

電離方式：ESI負(fù)離子模式；干燥氣：氮?dú)?，純度?9.9%，10 L/min；離子源溫度：300℃；采集模式：多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。

舒巴坦的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見表1。

表1　舒巴坦的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

2　結(jié)果與分析

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

考察了甲醇、0.4%乙酸、乙腈3種提取溶劑的提取回收率及凈化效果。結(jié)果表明，當(dāng)采用甲醇為提取溶劑時(shí)，質(zhì)譜的檢測效果最好，沒有雜峰干擾。舒巴坦的提取回收率比較穩(wěn)定，均能獲得81.5%～85%的回收率。因此，最終選擇的提取溶劑為甲醇。

2.2色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

3種色譜柱分離舒巴坦MRM色譜見圖1。

選取了 Agilent公司的Poroshell 120SB-C18型、BEH-C18型和SB-C18型3種色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用SB-C18型色譜柱和BEH-C18型色譜柱時(shí)，舒巴坦峰形較差，不利于結(jié)果定性及定量分析；采用Poroshell 120SB-C18型色譜柱時(shí)，舒巴坦響應(yīng)值較高，且峰形和保留時(shí)間都比較好。因此，最終選擇色譜柱為Poroshell120SB-C18型。

圖13種色譜柱分離舒巴坦MRM色譜

2.2.2流動相的選擇

考察了甲醇和水、乙腈和水作為流動相對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動相為甲醇-水溶液體系時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)值最高，并且能夠獲得色譜分離效果，色譜峰形也較好。因此，最終選擇流動相為甲醇-水溶液（配比為10∶90）。

2.2.3質(zhì)譜條件的選擇

舒巴坦離子MRM色譜及質(zhì)譜見圖2。

舒巴坦的化學(xué)結(jié)構(gòu)表明，此化合物進(jìn)行電噴霧負(fù)離子模式掃描。在負(fù)離子模式下，舒巴坦產(chǎn)生140.1 m/z和64.1 m/z的特征離子。最終確定舒巴坦的定量離子對為 232.1/140.1 m/z，定性離子對為232.1/64.1 m/z。對質(zhì)譜錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，確定了舒巴坦的最佳質(zhì)譜參數(shù)，質(zhì)譜條件見1.2.3。在選定的質(zhì)譜參數(shù)下，舒巴坦均響應(yīng)良好。

2.3方法的驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法，得到液態(tài)乳中的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？瞻谆|(zhì)溶液，采用1.2.1中所描述的樣品前處理方法制得。使用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至1.5，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，得到舒巴坦的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限。

試驗(yàn)采用空白樣品加標(biāo)法，分別以各定量離子3倍和10倍信噪比（S/N）對應(yīng)樣品中目標(biāo)化合物的濃度，得到檢出限和定量限。

舒巴坦的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2，空白樣品、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)樣品（50 μg/kg）的MRM色譜見圖3。

圖3　空白樣品、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)樣品（50 μg/kg）的MRM色譜

2.3.2方法精密度和回收率

本試驗(yàn)選取3類空白樣品（純牛奶、調(diào)制乳、原料乳）加標(biāo)的方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，在空白樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平（1.5，5.0，50 μg/kg） 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.1描述的方法進(jìn)行測定，每個(gè)添加水平平行測定6次。

舒巴坦在樣品中的回收率和精密度見表3。

表3　舒巴坦在樣品中的回收率和精密度

試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率在81.8%～87.8%范圍內(nèi)，精密度（RSD）在3.3%～4.4%范圍內(nèi)，表明該方法回收率良好，數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定，可以滿足實(shí)際檢測要求。

3　結(jié)論

建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測液態(tài)乳及原料乳中舒巴坦殘留量的方法，該方法具有簡便快捷、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、回收率穩(wěn)定等特點(diǎn)，適用于液態(tài)乳及原料乳中舒巴坦的檢測與驗(yàn)證。

［1］劉珊珊，單藝，滿朝新，等.高效液相色譜——二極管陣列檢測法測定原料乳中的舒巴坦 ［J］.食品工業(yè)科技，2012（16）：64-66.

［2］崔向云，常建軍，張雪峰，等.UPLC-MS/MS法測定液態(tài)乳中舒巴坦殘留 ［J］.中國乳品工業(yè)，2014（10）：42-43，45.

［3］張立，李娜思，馮峰，等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素及其酶抑制劑 ［J］.食品安全檢測質(zhì)量學(xué)報(bào)，2013，6（4）：1 821-1 827.

［4］馬曉斐，張敬軒，李揮，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定液態(tài)奶中克拉維酸和舒巴坦 ［J］.食品科學(xué)，2013（6）：257-260.

［5］郭啟雷，王浩，楊紅梅，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中舒巴坦和他唑巴坦 ［G］//2009年中國有機(jī)質(zhì)譜年會論文集.北京：中國物理學(xué)會質(zhì)譜分會有機(jī)質(zhì)譜專業(yè)委員會，2009.◇

Determination of Sulbactam Content in Milk and Raw Milk by LC-MS/MS Method

AN Yu，WANG Huifang，ZHANG Minjuan，TANG Xin，LI Xiao，SU Jingjing
（Shaanxi Testing Institute of Product Quality Supervision，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

To develop a method for determination of sulbactam content in milk and raw milk by using LC-MS/MS.Samples are extracted by solvent extraction and cleaned up before chromatographic separation on a Poroshell 120SB-C18column using a mobile phase consisting of water and methanol by isocratic elution.The dyes are analyzed by LC-MS/MS in multiple reaction monitoring（MRM） mode and quantified by the external standard method.The limits of detection for the dyes varied from 0.5 μg/kg.The average recoveries across high，medium and low spike levels are between 81.8%～87.8%with a relative standard deviation（RSD）in the range of 3.3%～4.4%.The method is simple，rapid，sensitive，accurate and suitable for determination of sulbactam content in milk and raw milk.

sulbactam；LC-MS/MS；milk；raw milk；determination

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.042

1671-9646（2016）06b-0052-03

2016-04-21

安瑜（1985— ），女，碩士，工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)。