李熙晨　吳垠　李曉東　汪濤

摘要：為了研究金屬離子銅、鎳對(duì)海帶生長(zhǎng)及相關(guān)生理指標(biāo)變化的影響，對(duì)不同濃度金屬離子進(jìn)行7 d的海帶室內(nèi)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。對(duì)其生長(zhǎng)情況、金屬離子吸附、可溶性糖、蛋白含量、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，海帶對(duì)Cu²⁺的敏感度高于Ni²⁺，在Cu²⁺的作用下，海帶的生長(zhǎng)受到明顯的抑制作用，出現(xiàn)厚度變薄、甚至腐爛等癥狀。低濃度的Ni²⁺能促進(jìn)海帶可溶性糖的合成，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)則抑制，Ni²⁺對(duì)實(shí)驗(yàn)藻海帶蛋白含量無明顯影響。而在對(duì)兩種金屬離子的吸附方面，海帶對(duì)Cu²⁺的吸附量遠(yuǎn)大于對(duì)Ni²⁺的吸附量。

關(guān)鍵詞：海帶；銅離子；鎳離子；吸附；蛋白、可溶性糖

海帶（Laminaria japonica）是我國海水養(yǎng)殖的主要大型藻類之一，是北方地區(qū)傳統(tǒng)的養(yǎng)殖對(duì)象。海帶作為人們餐桌上的美食，具有補(bǔ)充活性碘、降低血膽固醇、軟化血管、緩解高血壓、抗腫瘤、抗輻射、提高免疫力等獨(dú)特的醫(yī)療保健作用。同時(shí)海帶還是制碘、生產(chǎn)甘露醇和褐藻膠的重要工業(yè)原料。但是隨著工業(yè)的發(fā)展，大量重金屬以各種途徑排入土壤和天然水環(huán)境中，使水體產(chǎn)生嚴(yán)重污染。研究顯示，當(dāng)水環(huán)境中的Hg、Cd、Ni、Pb等重金屬離子濃度過高時(shí)，對(duì)藻類的生長(zhǎng)代謝有抑制作用，畸變?cè)孱惖募?xì)胞形態(tài)，阻止細(xì)胞分裂，破壞細(xì)胞內(nèi)含物，降低酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致藻類的死亡。近年來一些海區(qū)養(yǎng)殖的海帶發(fā)生大規(guī)模腐爛死亡現(xiàn)象，究其原因包括生態(tài)因子變化、病害等，許多研究工作者對(duì)海帶潰爛死亡問題的研究主要集中在以微生物病原菌感染后海帶的變化方面。而對(duì)重金屬污染導(dǎo)致海帶生理變化方面的研究尚缺乏系統(tǒng)研究。本文在實(shí)驗(yàn)生態(tài)條件下，選取兩種重金屬銅和鎳離子，分析其對(duì)海帶生長(zhǎng)、富集及相關(guān)生理指標(biāo)的影響，為重金屬的生態(tài)毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藻體

實(shí)驗(yàn)用海帶采自大連市金州登沙河灣海域，將生長(zhǎng)正常、結(jié)構(gòu)完整海帶30株低溫條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

取容積為180 L的水槽10個(gè)，加入已經(jīng)過濾好的海水，按順序編號(hào)，將從實(shí)驗(yàn)海域采集的海帶依次放入水槽中，放入前測(cè)定海帶長(zhǎng)度和濕重。在充氣情況下暫養(yǎng)兩天。

重金屬Cu²⁺和Ni²⁺采用硫酸銅和氯化鎳的鹽溶液，由低到高依次加入到暫養(yǎng)海帶的水槽中，使兩種金屬離子形成5個(gè)濃度梯度，分別是0、0.25、0.5、1、5 mg/L。培養(yǎng)24 h后，觀察海帶性狀并記錄，同時(shí)更換新的海水并加入同等藥品，重復(fù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期為7 d。養(yǎng)殖過程中水溫為4.5～5.0℃，光照2 000～5 000 1x，氨氮≤0.2 mg/L，24 h充氣。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量海帶的長(zhǎng)度和濕重，并取樣品測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3生長(zhǎng)及生理指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定之前，先用純水將樣品沖洗干凈，然后用吸水紙擦干表面水分，之后裁剪并稱重。

1.3.1海帶中重金屬含量的檢測(cè) 參照國標(biāo)GB/T5009.13—2003、GB/T5009.17—2003的測(cè)定方法，采用石墨爐原子吸收光度計(jì)，微波消解儀，原子熒光光度計(jì)等。

1.3.2海帶可溶性糖、蛋白含量的測(cè)定采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖，采用考馬斯亮蘭法測(cè)定可溶性蛋白。

1.3.3總抗氧化能力和超氧化物岐化酶（SOD）活性測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4統(tǒng)計(jì)與分析

測(cè)定的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan多重比較法比較各組間平均值的差異顯著性，以P<0.05為顯著性差異。

2結(jié)果

2.1生長(zhǎng)和形態(tài)變化

表1為不同濃度的鎳離子和銅離子對(duì)海帶生長(zhǎng)的影響。由表1可以看出，與對(duì)照組相比，在實(shí)驗(yàn)的鎳離子濃度范圍內(nèi)，各組海帶的增長(zhǎng)率無明顯差異（P>0.05），增重率差異顯著（P<0.05），0.50 mg/L實(shí)驗(yàn)組海帶的增重率和增長(zhǎng)率均高于對(duì)照組；而銅離子對(duì)海帶生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，空白組海帶與4個(gè)實(shí)驗(yàn)組海帶增長(zhǎng)率均差異顯著（P<0.05），1.0和5.0 mg/L實(shí)驗(yàn)組海帶增重率與前三組變化差異顯著（P<0.05）。

海帶形態(tài)變化顯示，添加不同濃度銅離子的海帶表面，陸續(xù)出現(xiàn)厚度變薄、局部腐爛的現(xiàn)象，濃度越高現(xiàn)象越明顯。添加鎳離子的海帶表觀形態(tài)方面未見明顯變化。

2.2海帶對(duì)兩種金屬離子的吸附

如圖1、2所示隨著Cu2+、Ni2+濃度的升高，海帶對(duì)于兩種離子的吸附均為遞增趨勢(shì)，在1.00mg/L到5.00 mg/L時(shí)變化最為顯著（P<0.05），且在5.00 mg/L時(shí)為最高。兩者比較海帶對(duì)CC+的吸附性更強(qiáng)。

2.3可溶性糖含量的變化

從圖3可以看出，銅離子對(duì)海帶的影響隨濃度的升高呈現(xiàn)遞減的狀態(tài)。Cu²⁺在0.25 mg/L時(shí)下降最顯著。而Ni²⁺對(duì)海帶糖含量的影響與銅離子不同，呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，在0.50mg/L和1.00 mg/L時(shí)顯著上升（P<0.05）。

2.4可溶性蛋白的含量變化

從圖4可以看出Cu²⁺對(duì)海帶蛋白影響的趨勢(shì)是隨濃度的升高總體先上升后下降，并在濃度為0.25 mg/L時(shí)顯著上升（P<0.05），以后隨著濃度的上升顯著下降（P<0.05）。Ni²⁺對(duì)海帶的影響呈總體上升的趨勢(shì)，但上升均不顯著（P>0.05）。

2.5總抗氧化力能力的變化

如圖5所示銅離子和鎳離子對(duì)海帶總抗氧化力的影響趨勢(shì)不同，在銅離子作用下海帶的總抗氧化力表現(xiàn)為先下降再升高，且變化均不顯著（P>0.05）；而在鎳離子的作用下海帶總抗氧化力表現(xiàn)為先升高再降低，0.25和0.50 mg/L時(shí)上升最顯著（P<0.05），當(dāng)濃度高于0.50 mg/L，總抗氧化力與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。

2.6 SOD含量的變化

從圖6可以看出不同濃度Cu²⁺對(duì)海帶SOD的影響隨濃度的升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，在0.25、0.50 mg/L時(shí)下降最為顯著（P<0.05）。而Ni2+在濃度0.25、1.00、5.00 mg/L時(shí)對(duì)海帶SOD的影響為上升，但不顯著（P>0.05），但在0.5 mg/L時(shí)顯著下降（P<0.05）。

3討論

在已研究過的金屬中，Cu起著雙重作用，少量的Cu是藻類代謝過程中的必需品，但高濃度的Cu對(duì)藻類具有毒害作用，Cu是一種細(xì)胞代謝抑制劑。Ni同樣能被藻類積累，有研究表明Ni對(duì)纖維藻細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，Ni能與氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA和RNA相結(jié)合，阻礙細(xì)胞的分裂，破壞DNA的結(jié)構(gòu)。姜彬慧、林碧琴的研究表明，當(dāng)Ni濃度≥0.4 mg/L時(shí)，藻類生長(zhǎng)受到明顯抑制，當(dāng)濃度為3.2 mg/L時(shí)，其蛋白質(zhì)和氨基酸的含量明顯下降。孔繁翔對(duì)不同濃度的Ni²⁺對(duì)羊角月芽藻的生長(zhǎng)速度、蛋白質(zhì)含量、ATP水平、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）、酸性磷酸酶及硝酸還原酶活性的影響試驗(yàn)，研究表明，在所試濃度范圍內(nèi)Ni對(duì)羊角月芽藻的生長(zhǎng)速度有抑制作用，但單位藻培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)隨著Ni2+濃度的增加而增加，同時(shí)高濃度的Ni2+對(duì)酶的活性有明顯抑制作用，藻細(xì)胞中ATP水平隨著濃度的增加而下降，說明重金屬離子的存在會(huì)改變?cè)寮?xì)胞內(nèi)能量的代謝。

糖類和蛋白是生物體的基礎(chǔ)代謝物，對(duì)植物的生長(zhǎng)、生理活動(dòng)有重要影響。根據(jù)研究，植物的病害與體內(nèi)可溶性糖含量有一定關(guān)系。吳海燕等報(bào)道水稻感染小球菌核病菌后植株體內(nèi)可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)，同時(shí)在海帶病爛過程中，隨褐藻酸降解菌數(shù)量的增多，海帶的呼吸作用增強(qiáng)，糖的利用速率加快，導(dǎo)致糖含量降低。在本實(shí)驗(yàn)中Cu²⁺感染過的海帶發(fā)生腐爛，隨著病爛的嚴(yán)重可溶性糖含量逐漸降低，而沒有發(fā)生病爛的Ni²⁺組海帶沒有這種現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)中，Cu²⁺組可溶性蛋白的含量在低濃度下先有小幅升高，然后逐漸下降，這與王海河等對(duì)病毒侵染煙草后可溶性蛋白含量變化的研究結(jié)果相似，可溶性蛋白含量的升高可能是由于海帶對(duì)重金屬的侵染作出了積極反應(yīng)，體內(nèi)產(chǎn)生一些抗性蛋白，這也導(dǎo)致了蛋白含量有所升高。而隨著離子濃度和病爛情況的加重，海帶的防御能力遭到破壞，抑制蛋白質(zhì)合成，加速蛋白質(zhì)的分解，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，破壞蛋白質(zhì)分子，從而使可溶性蛋白含量降低。

在逆境脅迫下，植物體活性氧的產(chǎn)生能力會(huì)強(qiáng)于清除能力。重金屬離子脅迫與其他形式的氧化脅迫是相似的，某些活性氧可以充當(dāng)信號(hào)分子，在重金屬感染后傳遞信號(hào)，從而使植物組織產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)。SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道屏障，具有維持活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)生病爛的高濃度Cu²⁺感染下可見，在海帶抗病反應(yīng)中SOD起重要的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，海帶在高濃度Cu²⁺的脅迫下發(fā)生病爛，SOD逐漸升高。在Ni²⁺脅迫下未發(fā)生病爛，SOD變化不顯著。本實(shí)驗(yàn)表明高濃度Cu²⁺對(duì)海帶的毒性作用大于Ni²⁺。