克羅恩病和健康兒童血清細(xì)胞因子水平的病例對照研究

盧華君 趙忠艷 李小莉 閆秀梅 林小春 黃開宇

·論著·

克羅恩病和健康兒童血清細(xì)胞因子水平的病例對照研究

盧華君 趙忠艷 李小莉 閆秀梅 林小春 黃開宇

目的 觀察克羅恩病(CD)患兒血清細(xì)胞因子水平，探討細(xì)胞因子水平紊亂在兒童克羅恩病發(fā)病中的作用。方法 納入2013年1月至2015年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院(我院)兒內(nèi)科住院的確診CD患兒(病例組，根據(jù)CD活動(dòng)度分為不同亞組)和同期在我院門診體檢的健康兒童，采用流式分析技術(shù)檢測晨起空腹靜脈血血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A的水平。結(jié)果 病例組32例，男18例，女14例，年齡(8.5±4.3)歲，其中CD輕度活動(dòng)亞組12例，CD中重度活動(dòng)亞組20例；對照組30名，男18名，女12名，年齡(10±3.5)歲。病例組和對照組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組患兒血清IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平高于對照組，血清IL-10和IFN-γ水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，根據(jù)兒童CD活動(dòng)指數(shù)(PCDAI)評分為中重度活動(dòng)亞組患兒的血清IL-2、TNF-α和IL-17A水平高于輕度活動(dòng)亞組患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 與健康兒童相比，CD患兒存在明顯的免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平變化，而且疾病活動(dòng)度不同其細(xì)胞因子水平亦有差異，提示細(xì)胞因子水平紊亂在兒童CD發(fā)病及病情的發(fā)展中有重要作用。

克羅恩??； 細(xì)胞因子； 流式細(xì)胞術(shù)； 兒童

克羅恩病(CD) 是一種非特異性的消化道炎癥性疾病。CD發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，既往研究支持CD是一種腸道免疫平衡失調(diào)的表現(xiàn)，且輔助性T細(xì)胞(Th)是主要的參與者。TNF-α在CD發(fā)病中的重要作用受到廣泛關(guān)注，但其他細(xì)胞因子是否參與發(fā)病目前還不清楚。CD臨床表現(xiàn)復(fù)雜，病變可累及消化道的各個(gè)部位，特別是末段回腸

和結(jié)腸，也可累及全身各個(gè)系統(tǒng)。兒童CD的診斷和治療方案大多借鑒于成人方案，但臨床發(fā)現(xiàn)其與成人CD又有著不同之處。用于兒童CD治療的藥物包括氨基水楊酸類藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑，但不同患兒藥物治療的療效個(gè)體差異很大，且目前尚無統(tǒng)一且絕對有效的治療方案[1]。如果能深入探討CD患兒的免疫應(yīng)答變化，將有助于闡明兒童CD的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行個(gè)體化免疫干預(yù)治療。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 采用病例對照研究設(shè)計(jì)。觀察CD患兒(病例組，根據(jù)CD活動(dòng)度分為不同亞組)和正常兒童(對照組)血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和L-17A的水平。

1.2 兒童CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]診斷依靠臨床、影像、內(nèi)鏡表現(xiàn)和病理檢查結(jié)果綜合判斷。影像學(xué)和內(nèi)鏡檢查：①非連續(xù)性節(jié)段性病變，②鋪路石表現(xiàn)或縱行潰瘍，③全壁炎癥病變；組織病理或大體標(biāo)本：④非干酪肉芽腫、裂隙潰瘍，⑤瘺管，⑥肛門部病變。符合①～③擬診CD；擬診CD+符合⑤～⑥中任何1項(xiàng)為確診CD；符合④項(xiàng)+①～③中任何2項(xiàng)確診CD。

1.3 CD活動(dòng)度評價(jià) 依據(jù)兒童CD活動(dòng)指數(shù) (PCDAI)進(jìn)行評分。評分項(xiàng)目包括腹痛、每日便次、一般情況、體重、身高(診斷時(shí))或身高速率、腹部情況、肛旁疾病、腸外疾病、紅細(xì)胞壓積、血沉及白蛋白水平11個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目非等距賦分，0、2、5或10分。11～30分為輕度活動(dòng)(輕度活動(dòng)亞組)，≥31分為中/重度活動(dòng)(中重度活動(dòng)亞組)。

1.4 病例組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 2013年1月至2015年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院(我院)兒內(nèi)科住院的達(dá)確診標(biāo)準(zhǔn)的CD患兒，且排除其他慢性腸道感染性疾病、腸結(jié)核、腸道惡性淋巴瘤或自身免疫性疾病者。

1.5 對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 在病例組全部病例入組完成后依據(jù)病例組的年齡、性別構(gòu)成按比例選取健康對照組，所有對照組對象均為我院門診體檢的健康兒童，排除急性病毒感染、慢性腸道感染性疾病、結(jié)核感染或嚴(yán)重肝腎心功能不全者。

1.6 倫理和知情同意 血液標(biāo)本的取得病例組患兒和對照組兒童家屬同意。對照組兒童血清標(biāo)本均為到我院就診行血液檢查或體檢血生化時(shí)取得。

1.7 觀察指標(biāo)及其檢測方法 觀察指標(biāo)為血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平。病例組和對照組兒童晨起空腹用干燥試管采集靜脈血2 mL，離心取血清用EP管分裝，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞因子檢測方法采用流式微球分析(CBA)技術(shù)，檢測方法參考文獻(xiàn)[2]。檢測試劑盒由BD公司提供。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入排除標(biāo)準(zhǔn)的CD患兒32例進(jìn)入本文分析，男18例，女14例，年齡7～15(8.5±4.3)歲。對照組30名健康兒童進(jìn)入本文分析，男18名，女12名，年齡6～13(10±3.5)歲。兩組年齡(t=1.87,P>0.05)、性別(χ2=0.096,P>0.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)PCDAI評分，輕度活動(dòng)亞組12例，中重度活動(dòng)亞組20例。

32例CD患兒均行腹部B超檢查，其中17例有明顯的腸壁增厚、12例有腸管節(jié)段性擴(kuò)張、3例右下腹腫塊。6例行胃腸道超聲檢查未發(fā)現(xiàn)異常。8例行全胃腸道鋇劑造影，其中5例主要表現(xiàn)為腸黏膜紊亂，腸壁節(jié)段性增厚、狹窄、僵硬；2例結(jié)腸結(jié)節(jié)狀充盈缺損；1例腸管擴(kuò)張，腸間隙增寬，結(jié)腸袋形消失。

32例CD患兒均行結(jié)腸鏡檢查，其中21例腸黏膜局灶性充血、水腫、糜爛、片狀或縱形潰瘍形成，部分黏膜可有結(jié)節(jié)樣或息肉樣增生表現(xiàn)；8例明顯鵝卵石樣表現(xiàn)；3例結(jié)腸多發(fā)息肉。2例行膠囊內(nèi)鏡檢查示，小腸黏膜多發(fā)充血水腫潰瘍、多發(fā)息肉樣隆起，小腸中上段多發(fā)裂隙樣潰瘍和鵝卵石樣改變。

32例CD患兒均以結(jié)腸鏡活檢組織行病理檢查，均示腸黏膜固有層疏松水腫，大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，3例非干酪樣肉芽腫。

2.2 病例組與對照組血清細(xì)胞因子水平比較 圖1和表1示，病例組患兒血清IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平高于對照組，而血清IL-10和IFN-γ水平則明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病例組不同活動(dòng)度亞組血清細(xì)胞因子水平比較，血清IL-2、TNF-α和IL-17A水平中重度活動(dòng)亞組高于輕度活動(dòng)亞組(P<0.05)，血清IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ水平在兩個(gè)亞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 病例組和對照組血清細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

注t1和p1：病例組與對照組比較；t2和p2：中重度活動(dòng)亞組與輕度活動(dòng)亞組比較

3 討論

既往研究[3]認(rèn)為CD是一種腸道免疫平衡失調(diào)的表現(xiàn)。腸道的免疫平衡由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫性T細(xì)胞調(diào)控。免疫性T細(xì)胞分為輔助性T細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。Th在不同細(xì)胞因子的刺激下可以分為Th1和Th2。Th1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等；Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等。目前認(rèn)為，CD的發(fā)病是以Th1介導(dǎo)為主。Th1型細(xì)胞分泌的TNF-α已引起廣泛關(guān)注，它是CD發(fā)病中一個(gè)重要的促炎因子。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，去除小鼠T細(xì)胞TNF-α基因的3’非翻譯區(qū)會(huì)導(dǎo)致TNF-α水平升高并產(chǎn)生CD樣的表型，形成節(jié)段性累及腸壁全層的肉芽腫性腸炎。

IFN-γ是最典型的Th1型細(xì)胞因子，具有抗炎癥活性，其降低可能導(dǎo)致機(jī)體抵抗炎癥反應(yīng)的能力降低。Th17細(xì)胞是一群新近鑒定的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，該細(xì)胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6和IL-23等細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的促炎癥作用。其中最主要的是IL-17A，它與Th1、Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞一起廣泛參與了機(jī)體的免疫防御及免疫調(diào)節(jié)過程。IL-17可能通過激活細(xì)胞因子、趨化因子，增加TNF-α誘導(dǎo)的消化道平滑肌細(xì)胞的IL-6表達(dá)，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟和激活。Strober等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在CD患者炎癥腸道黏膜中，Th1相關(guān)的細(xì)胞因子(如TNF-α、IFN-γ)和Th17相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-17A)顯著升高。本研究中CD患兒血清IFN-γ和IL-10明顯低于對照組，而IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平則明顯高于對照組。與對照組兒童相比，CD患兒血清IL-10濃度降低，提示可能由于存在某種因素抑制了IL-10的產(chǎn)生，導(dǎo)致不能削弱機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡。由于IL-4的異常升高可刺激B細(xì)胞分泌IgE，而IFN-γ是一個(gè)IgE合成的潛在抑制物，那么IL-4與IFN-γ的失衡就可能使患兒IgE水平增高，從而引起了一系列腸黏膜炎癥改變。CD患兒血清IL-2水平的升高可能與多種細(xì)胞因子水平的變化并相互誘生有關(guān)。CD患兒巨噬細(xì)胞合成并分泌大量TNF-α，直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，加重消化道組織的損傷。消化道組織的損傷又促使TNF-α因子的釋放，形成惡性循環(huán)，造成消化道炎癥反應(yīng)的反復(fù)發(fā)生和遷延不愈。本研究發(fā)現(xiàn)CD患兒血清細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17A較對照組顯著升高，而且中重度活動(dòng)CD患兒血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平顯著高于輕度活動(dòng)CD患兒，而IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平則無顯著性差異。提示TNF-α、IL-2和IL-17A在兒童CD疾病發(fā)展及活動(dòng)中可能起重要作用。

兒童CD的治療目前尚無統(tǒng)一且絕對有效的方案。除了一般營養(yǎng)治療外，糖皮質(zhì)激素、5氨基水楊酸(5-ASA)、6-巰基嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉秦和沙利度胺等均可用于兒童CD的治療。有研究者認(rèn)為，CD患兒在患病早期應(yīng)用抗TNF-α制劑治療的效果優(yōu)于一般免疫治療[3]。英夫利西(IFX)為抗TNF-α單克隆抗體，可通過與巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞表面表達(dá)的TNF-α高親和力結(jié)合而拮抗TNF-α的生物活性。通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用以及影響細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終加速細(xì)胞周期阻滯、凋亡以及抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生[5]。

本研究結(jié)果提示，與健康兒童相比，CD患兒存在血清細(xì)胞因子水平紊亂，不同疾病活動(dòng)度的CD患兒細(xì)胞因子水平亦有差異，提示細(xì)胞因子水平紊亂在兒童CD發(fā)病及病情的發(fā)展中有重要作用。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)消化學(xué)組兒童炎癥性腸病協(xié)作組，陳潔, 許春娣, 等. 兒童炎癥性腸病診斷規(guī)范共識意見. 中國實(shí)用兒科雜志, 2010, 25(4): 263-265

[2] 盧華君，趙忠艷，李云芳，等. 呼吸道腺病毒感染患兒細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞亞群的研究.中國人畜共患病學(xué)報(bào), 2013, 29(8): 808-816

[3] Walters TD, Kim MO, Denson LA, et al. Increased effectiveness of early therapy with anti-tumor necrosis factor-α vs an immunomodulator in children with Crohn's disease. Gastroenterology, 2014, 146(2): 383-391

[4] Strober W, Fuss IJ. Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology, 2011, 140(6): 1756-1767

[5] 吳芳，占強(qiáng). 英夫利西單抗治療克羅恩病中免疫平衡及細(xì)胞因子的變化和意義. 醫(yī)學(xué)綜述, 2012, 18(23): 3947-3949

(本文編輯：張崇凡)

Acase-controlstudyofserumlevelsofcytokinesinCrohn'sdiseaseandhealthychildren

LUHua-jun,ZHAOZhong-yan,LiXiao-li,YANXiu-mei,LINXiao-chun,HuangKai-yu

(DepartmentofPediatricGastroenterology,YuyingChildren'sHospital,Wenzhou325027,China;TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China)

Corresponding Author：HUANG Kai-yu，E-mail: hky3027256@163.com

ObjectiveTo detect the serum levels of cytokines in children with Crohn's disease (CD), in order to explore the role of cytokine levels disorder on the pathogenesis of CD in children.MethodsHospitalized CD patients diagnosed between January 2013 and December 2015 in Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University (Case group was divided into different subgroups according to CD activity)，and outpatient healthy children at the same period were enrolled as case group and control group, respectively. The levels of serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, and IL-17A were detected by flow cytometry in the morning with an empty stomach. ResultsThere were 32 cases of children with CD in case group, including 18 males, 14 females, with average age of (8.5±4.3) years; 12 cases in mild activity CD subgroup, 20 cases in moderate and severe activities CD subgroup.There were 30 healthy children in control group, including 18 males and 12 females , with average age of (10±3.5) years. There was no statistically significant difference in age and gender between case group and control group(P>0.05).The levels of serum IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α, and IL-17A in case group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). And the levels of serum IL-10 and IFN-γ in case group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). In addition，the levels of serum TNF-α, IL-2 and IL-17A in moderate and severe activities CD subgroup identified by the pediatric CD activity index (PCDAI) were significantly higher than those in mild activity CD subgroup (P<0.05).ConclusionCompared with healthy children, CD children existed obvious immune related cytokines level change.With the change of CD activity, the levels of cytokines were also different. It suggested that cytokine levels disorder played an important role in the development of CD in children.

Crohn's disease; Cytokine; Flow cytometry; Children

1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 溫州，325027；2育英兒童醫(yī)院兒童消化科 溫州，325027

黃開宇，E-mail: hky3027256@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.012

2016-10-27

2016-11-18)