長(zhǎng)清產(chǎn)栝樓3個(gè)品系果皮水提取物紅外光譜的三級(jí)鑒定

于京平　張永清

(1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

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長(zhǎng)清產(chǎn)栝樓3個(gè)品系果皮水提取物紅外光譜的三級(jí)鑒定

于京平1,2張永清2

(1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

摘要：采用紅外光譜三級(jí)鑒定法，對(duì)長(zhǎng)清產(chǎn)3個(gè)品系栝樓果皮水提取物進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一維紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜部分吸收峰的峰形、峰位和峰強(qiáng)具有一定的差異，二維相關(guān)譜中自動(dòng)峰的峰數(shù)、峰位和峰強(qiáng)均有明顯的區(qū)別。紅外光譜三級(jí)鑒定法可以快速、準(zhǔn)確地分析與鑒定3個(gè)品系栝樓果皮。

關(guān)鍵詞：栝樓；果皮；水提取物；紅外光譜三級(jí)鑒定法

瓜蔞皮為葫蘆科植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.的干燥成熟果皮，可清熱化痰、利氣寬胸[1]。山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)是瓜蔞的道地產(chǎn)區(qū)，藥材質(zhì)量上乘。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇、人工定向培育及外來(lái)種質(zhì)的引進(jìn)，長(zhǎng)清栝樓的遺傳特性發(fā)生了明顯變異，形成了不同的種質(zhì)[2-4]。近年來(lái)有學(xué)者對(duì)瓜蔞皮外部形態(tài)進(jìn)行了詳盡描述，但是由于性狀相似，鑒別難度大。

研究表明，瓜蔞皮中分離鑒定到的化合物主要包括揮發(fā)油、多糖、黃酮和核苷等成分[5-6]。而中藥發(fā)揮臨床療效是其所含物質(zhì)群的整體作用的結(jié)果，而并非某單一的化學(xué)成分。只檢測(cè)其中一種或幾種指標(biāo)成分并不能全面反映中藥質(zhì)量，因此急需一種快速、有效且可行的分析方法對(duì)中藥提取物進(jìn)行整體系統(tǒng)的分析。紅外光譜的變化可以反映出中藥這一混合物體系在化學(xué)成分上的差別，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、測(cè)試速度快以及測(cè)試成本低等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別[7-11]。本文采用紅外光譜三級(jí)鑒定法，對(duì)長(zhǎng)清產(chǎn)3個(gè)品系栝樓果皮水提取物進(jìn)行了紅外光譜特征研究，旨在為其鑒定和開(kāi)發(fā)利用提供新方法。

1儀器與試藥

1.1儀器

FT-IR紅外光譜儀Spectrum One(美國(guó)Perkin-Elmer公司)，DTGS檢測(cè)器，50-886型變溫附件(Love Control公司)；Spectrum v3.02 操作軟件(美國(guó)Perkin-Elmer公司)。

1.2試劑

溴化鉀(光譜純)(Aladdin 公司，批號(hào)：P116273)；蒸餾水。

1.3樣品

所用樣品瓜蔞皮采自濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)馬山鎮(zhèn)北李村，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定，確認(rèn)為葫蘆科栝樓屬植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.。根據(jù)果皮形態(tài)特征分析，劃分為Ⅰ號(hào)、Ⅱ號(hào)、Ⅲ號(hào)3個(gè)品系。3個(gè)品系植株果皮外觀差異明顯，見(jiàn)表1 ～2。

表1　3個(gè)品系栝樓果皮外觀性狀

表2　3個(gè)品系栝樓果皮性狀特征及其變異程度

注：不同字母間表示有顯著性差異(P<0.05)

2方法

2.1樣品提取物的制備

分別取樣品粉末，過(guò)4號(hào)篩，用10倍量蒸餾水50 ℃超聲提取30 min(功率500 W，頻率40 kHz)，提取兩次，合并兩次提取液，真空減壓干燥，得到水提取物。

2.2樣品提取物的測(cè)定方法

將水提取物粉末3 mg與溴化鉀200 mg混合，烘干，研磨均勻壓片，測(cè)得一維譜圖。采用Spectrum for Windows軟件的求導(dǎo)數(shù)功能，13點(diǎn)平滑，得紅外二階導(dǎo)數(shù)譜圖。將溴化鉀壓片裝入變溫附件，通過(guò)程序控制從50 ℃逐步升溫到120 ℃，每隔10 ℃采集一次紅外光譜圖；對(duì)采集的一系列動(dòng)態(tài)光譜圖分別進(jìn)行基線校正；采用二維相關(guān)分析軟件對(duì)所得的系列譜圖進(jìn)行處理，得到不同波段的二維相關(guān)紅外光譜圖。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn)

取品系Ⅰ瓜蔞皮樣品，按照 2.1 項(xiàng)下方法制備樣品提取物，按照 2.2 項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定5次，用COMPARE計(jì)算相似度，測(cè)得相似度均大于0.999 0，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取品系Ⅰ瓜蔞皮樣品5 份，按照2.1 項(xiàng)下方法制備樣品提取物，按照 2. 2項(xiàng)下方法將樣品水提取物粉末與溴化鉀混合壓片測(cè)定，用COMPARE計(jì)算相似度，測(cè)得相似度均大于 0.989 0，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.42%，表明方法重復(fù)性良好。

3結(jié)果

3.13個(gè)品系栝樓果皮水提取物一維紅外光譜譜圖比較

以品系Ⅰ為標(biāo)準(zhǔn)，采用COMPARE比對(duì)軟件比較了3個(gè)品系栝樓果皮水提取物4 000～400 cm-1波段指紋區(qū)的一維紅外譜圖，得到3個(gè)品系的相關(guān)系數(shù)依次為：1.000 0、0.990 1、0.969 9，見(jiàn)圖1。紅外譜圖整體比較相似，我們推測(cè)3個(gè)品系栝樓果皮水提取物的主要化學(xué)成分類似。

圖1　3個(gè)品系栝樓果皮水提取物一維紅外光譜譜圖Fig.1　 FTIR spectra of the water soluble extracts in the peels of the three varieties of Trichosanthes kirilowii Maxim.

由圖1可以看出，三者在3 358、3 359、3 354 cm-1處各有寬而強(qiáng)的吸收峰，分析其為締合-OH伸縮振動(dòng)或者N—H伸縮振動(dòng)；2 933 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)而尖銳的吸收峰，歸屬為-CH2反稱伸縮振動(dòng)；1 607 cm-1附近的吸收峰歸屬為N—H的剪式振動(dòng)或者C=O伸縮振動(dòng)；1 400 cm-1附近的吸收峰歸屬為-CH2的剪式振動(dòng)；1 080 cm-1處吸收峰歸屬為環(huán)醚的反稱伸縮振動(dòng)；882 ～537 cm-1歸屬為-CH2的彎曲振動(dòng)；778 cm-1附近為極性較大的多糖類成分的特征峰。

3.23個(gè)品系栝樓果皮水提取物二階導(dǎo)數(shù)譜圖比較

圖2為3個(gè)品系栝樓果皮水提取物的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜(1850～ 800 cm-1)。

圖2　3個(gè)品系栝樓果皮水提取物二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜譜圖Fig.2　Second derivative spectra of the water soluble extracts in the peels of the three varieties of Trichosanthes kirilowii Maxim.

由圖2中可以看出，在高分辨的二階導(dǎo)數(shù)譜中譜峰特征均明顯增多，指紋特征放大。

品系Ⅲ 于1 780 cm-1處有明顯吸收峰，其他兩個(gè)品系此處無(wú)明顯吸收峰。3個(gè)品系在1 400～1 650 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的峰形、峰位和相對(duì)峰強(qiáng)度存在一定差異，品系Ⅱ、品系Ⅲ于1 384 cm-1處有明顯吸收峰，而品系Ⅰ吸收峰藍(lán)移至1 465 cm-1處；品系Ⅱ于1 299 cm-1處有明顯吸收峰，另外兩個(gè)品系此處無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明3個(gè)品系栝樓果皮所含的芳香類化合物具有區(qū)別。3個(gè)品系在1 000～1 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的峰形、峰位和相對(duì)峰強(qiáng)度存在一定差異，三者在1 046 cm-1附近峰形差別較大，品系Ⅰ在1 011 cm-1處的相對(duì)峰強(qiáng)度明顯低于其他兩個(gè)品系，說(shuō)明3個(gè)品系栝樓果皮所含的糖和糖苷類化合物具有區(qū)別。3.33個(gè)品系栝樓果皮水提取物二維相關(guān)紅外光譜比較

不同的基團(tuán)熱敏感性不同，反映在二維相關(guān)紅外光譜譜圖中即為自動(dòng)峰位置、峰數(shù)目或相對(duì)峰強(qiáng)的改變。二維相關(guān)紅外光譜反映的是動(dòng)態(tài)的特征，大大提高了圖譜的表觀分辨率及圖譜的識(shí)別能力，相比常規(guī)紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)譜鑒別特征更明顯。圖3、圖4所示分別為3個(gè)品系栝樓果皮水提取物1 375～800 cm-1、1375～1850 cm-1兩個(gè)區(qū)域的同步二維平面相關(guān)圖。

圖3　3個(gè)品系栝樓果皮水提取物二維相關(guān)紅外光譜譜圖Fig.3　Two-dimensional infrared (2D-IR) correlation spectroscopy of the water soluble extracts in the peels of the three varieties of Trichosanthes kirilowii Maxim.

圖4　3個(gè)品系栝樓果皮水提取物二維相關(guān)紅外光譜譜圖Fig.4　Two-dimensional infrared (2D-IR) correlation spectroscopy of the water soluble extracts in the peels of the three varieties of Trichosanthes kirilowii Maxim.

由圖3可以看出，在1 375 ～800 cm-1區(qū)域內(nèi)，3個(gè)品系栝樓果皮水提取物的二維相關(guān)譜中自動(dòng)峰的峰數(shù)和峰位均有明顯區(qū)別。3個(gè)品系自動(dòng)峰數(shù)目分別為8、9、7，三者最高自動(dòng)峰分別位于1 080、1 082、1 083 cm-1處；品系Ⅱ在865 cm-1處形成的交叉峰強(qiáng)高于其他兩個(gè)品系，說(shuō)明此吸收峰所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)隨著溫度的升高變化較明顯。根據(jù)以上差異，可以說(shuō)明三者糖類基團(tuán)均受溫度的影響，進(jìn)一步佐證了3個(gè)品系栝樓果皮具有不同的糖苷類化合物。

由圖4可以看出，在1 850～1 375 cm-1區(qū)域內(nèi)，3個(gè)品系栝樓果皮水提取物的二維相關(guān)譜中自動(dòng)峰的峰數(shù)和峰位，均有明顯區(qū)別。3個(gè)品系自動(dòng)峰數(shù)目分別為6、6、5；三者最高自動(dòng)峰分別位于1 573、1 567、1 575 cm-1處；3個(gè)品系在1 645 cm-1處的自動(dòng)峰強(qiáng)度差別明顯，由強(qiáng)到弱依次為品系Ⅰ、品系Ⅲ、品系Ⅱ。品系Ⅲ在1 645 、1 652 cm-1處出現(xiàn)明顯雙峰。三者在1 850～1 375 cm-1區(qū)域內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜的分析進(jìn)一步佐證了3個(gè)品系栝樓果皮具有不同的芳香類化合物。

4討論

紅外光譜技術(shù)具有宏觀、無(wú)損、快速、特征性強(qiáng)以及取樣量小等特點(diǎn)。每種化合物都有其特征的紅外光譜，由于不同藥材所含的化學(xué)成分不同，在紅外光區(qū)分子振動(dòng)的特征吸收峰位置、峰形和峰強(qiáng)也不同，因此紅外光譜具有“指紋”特征。中藥中各種化學(xué)成分只要在質(zhì)和量方面相對(duì)穩(wěn)定，并且樣品處理方法按統(tǒng)一要求進(jìn)行，中藥材的紅外光譜就具有客觀性和可重復(fù)性。近年來(lái)紅外光譜已被應(yīng)用于藥材真?zhèn)舞b別、道地性識(shí)別和指紋圖譜制定等領(lǐng)域。

對(duì)一些活性成分不明確的藥材，可以其提取物含量作為衡量藥材質(zhì)量的依據(jù)之一。我們通過(guò)紅外光譜三級(jí)宏觀指紋鑒定的方法對(duì)3個(gè)品系栝樓果皮水提取物進(jìn)行對(duì)比分析，從宏觀上比較植物組成上的差異，為化學(xué)成分的微觀分析提供依據(jù)。

研究結(jié)果顯示，從一維紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜中，可以看到3個(gè)品系栝樓果皮水提取物的紅外光譜圖整體峰形比較相似，但部分吸收峰的峰形、峰位和峰強(qiáng)有細(xì)微差別，這可能與各樣品所含成分的含量不同有關(guān)；3個(gè)品系栝樓果皮水提取物的二維相關(guān)紅外光譜譜圖差別明顯，三者的自動(dòng)峰數(shù)量不同，部分吸收峰峰強(qiáng)差異明顯,該研究結(jié)果為瓜蔞皮藥材鑒定提供了依據(jù)。我們認(rèn)為紅外光譜三級(jí)鑒定可以有效、快速地鑒別3個(gè)品系栝樓果皮。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.001

收稿日期：2015-05-14

基金項(xiàng)目：山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2008GG2NS02022)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程(2009LZ01-03)；濟(jì)南市科技局高校院所自主創(chuàng)新項(xiàng)目(200906028)；濱州醫(yī)學(xué)院科研啟動(dòng)基金(BY2014KYQD29)

作者簡(jiǎn)介：于京平(1984-)，女，醫(yī)學(xué)博士，講師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及其質(zhì)量控制。Email:yujingping69@163.com

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)03-0001-06

Three-step infrared macro-fingerprint identification of water extract in peels of three varieties ofTrichosantheskirilowiiMaxim. from Changqing

YU Jing-ping1,2, ZHANG Yong-qing2

(1. Binzhou Medical University, Yantai 264003, China;2. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Abstract∶We analyze water soluble extract in peels of three varieties of Trichosanthes kirilowii Maxim. from Changqing with three-step infrared macro-fingerprint identification method. Experimental results show that form, frequency and strength of partial absorption peaks of general and secondary derivative infrared spectra exhibit certain distinctions. Obvious differences exist in the number, frequency and strength of automatic peaks of 2D-IR spectra. Three-step infrared macro-fingerprint identification method therefore can be rapidly and accurately applied to analysis and identification of peels of three varieties of Trichosanthes kirilowii Maxim.

Key words∶Trichosanthes kirilowii Maxim.; peel; water extract; three-step infrared macro-fingerprint identification method

【中藥與天然活性產(chǎn)物】