付德來，種　鐵，李和程，張 鵬，劉洪濤，王子明

(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院：1.泌尿外科，2.麻醉科，陜西西安　710004)

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·基礎研究·

Shotgun技術篩選尿液中腎癌蛋白質標志物

付德來1，種鐵1，李和程1，張 鵬1，劉洪濤2，王子明1

(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院：1.泌尿外科，2.麻醉科，陜西西安710004)

摘要：目的尋找尿液中潛在的腎癌蛋白質標志物。方法收集腎癌患者根治性腎切除術前、術后、非腎癌對照者晨起第二次中段尿液標本，提取尿蛋白并經SDS-PAGE初步分離，尿蛋白酶解后通過高效液相色譜聯(lián)合電噴霧串聯(lián)質譜分析，結果整合后經Bioworks Browser 3.1軟件搜索SWISS-PROT和/或TREMBL人類蛋白質數據庫，鑒定差異蛋白。結果腎癌患者術前組、術后組、對照組分別收集獲得滿足條件的尿液標本32、32、34份，各組蛋白濃度分別為32.79、9.15、26.57 ug/uL，各組分別鑒定獲得獨特肽段727、679、753個，獨特肽段數≥1的蛋白群分別有278、237、259個，獨特肽段數≥2的蛋白群分別有83、92、106個。其中有5個獨特肽段數≥2的蛋白群在腎癌術前組特異表達，這5個蛋白中4個為免疫球蛋白類，1個為Lipocalin-2(LCN2)。結論LCN2在腎癌患者術前尿液中高可信表達，LCN2在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為尿液中腎癌標志物的意義值得進一步研究。

關鍵詞：腎癌；標志物；尿液；蛋白組學

腎癌又稱腎細胞癌，是最常見的腎臟惡性腫瘤。約30%腎癌患者在首次就診時已處于疾病晚期，目前晚期腎癌缺乏有效的治療手段，預后較差。尋找腎癌標志物對于提高腎癌的早期診斷水平，研究腎癌發(fā)病機制具有重要意義。尿液是尋找腎癌標志物的理想標本，我們前期通過磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術從多肽組的層面對尿液中腎癌標志物進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)了數個有意義的差異表達多肽峰。然而僅僅從多肽組的角度分析尿液中腎癌標志物是遠遠不夠的，腎癌相關大分子蛋白質也可能通過各種途徑進入尿液。本實驗擬通過shotgun蛋白質組學技術，對比分析腎癌患者根治性腎切除術前、術后及對照組尿液中蛋白質組表達差異，進一步從蛋白質組的層面探索尿液中可能存在的腎癌標志物。

1材料與方法

1.1研究對象按照知情同意的原則篩選2009年3月至2009年12月期間西安交通大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科住院患者和健康志愿者。所有入選研究對象均自愿參與本課題。入組腎癌患者均為行根治性手術治療的早期腎癌(美國癌癥聯(lián)合委員會AJCC腎癌TNM分期T1～2N0M0期)患者，且病理類型為腎透明細胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma，ccRCC)。

1.2主要儀器及試劑Zorbax 300SB-C18色譜柱購自美國Agilent Technologies公司，EttanTMMDLC高效液相色譜購自瑞典GE healthcare公司，LTQ離子阱質譜購自美國Thermo Finnigan公司，BioworksTM購自美國Thermo Finnigan公司。

1.3方法

1.3.1尿液的收集與保存收集患者入院第2天及術后第7天晨起空腹第二次中段尿。尿液標本4 000 r/min離心10 min，獲得的上清液2 mL/管分裝后-80 ℃保存。從尿液標本收集到離心完畢分裝凍存在1 h內完成。

1.3.2尿蛋白的濃縮與提取(1)超濾法濃縮尿蛋白:凍存的尿液標本4 ℃環(huán)境下融化，采用截留分子質量(Molecular Weight Cutoff，MWCO)為50 ku的超濾管進行超濾，超濾管上層液體轉移至1.5 mL EP管，下層液體采用MWCO為3 ku的超濾管再次進行超濾濃縮。兩次超濾液混合待用。

(2)三氯醋酸-丙酮沉淀法提取尿蛋白:①超濾液中加入適當體積的100%三氯醋酸(TCA)溶液，使混合液中TCA濃度為10%，充分混勻后冰浴中放置10 min；②14 000 r/min離心10 min，得到蛋白沉淀；③沉淀物中加入200 μL冷丙酮(-20 ℃預冷30 min)，混勻器充分混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清;④重復步驟③兩次，以盡量洗凈沉淀中的TCA;⑤棄上清，所得蛋白沉淀物室溫放置30 min使丙酮揮發(fā)、干燥;⑥干燥后的蛋白樣品分裝后-80 ℃保存。

1.3.3蛋白混合物SDS-PAGE電泳初步分離本實驗采用12%的分離膠、5%的積層膠，SDS-PAGE電泳分離蛋白混合物。電泳完畢2%的考馬斯亮藍R-250染色30 min，脫色直至凝膠背景變白。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描獲得圖像。

1.3.4膠內蛋白質酶解根據SDS-PAGE凝膠中蛋白分離的情況，將各組蛋白泳道切為4段(圖1)，將各段蛋白切為約1 mm3大小的膠粒。同時切下空白條帶作為對照。所有的膠粒用超純水清洗、脫色液(30%乙腈，100 mmol/L NH4HCO3)脫色，直至膠粒無色透明。抽真空離心干燥，直至膠粒變成白色顆粒狀。每管加入90 μL NH4HCO3(100 mmol/L)、10 μL DTT(100 mmol/L)，56 ℃水浴孵化30 min還原蛋白質。測序級胰酶4 ℃酶解30 min，將蛋白酶解為肽段。加100 uL提取液(50%ACN/5%甲酸)提取肽段，抽真空離心干燥，-80 ℃保存待用。

1.3.5高效液相色譜聯(lián)合電噴霧串聯(lián)質譜分析肽段經洗脫、上樣、平衡、分離等步驟后，通過串聯(lián)質譜進行分析。采用正離子模式，優(yōu)化后質譜參數設置為：電噴霧電壓3.2 kV，解吸電壓60 V，質譜檢測范圍400～1 600 Da，加熱快溫度設置為176 ℃。每次全掃描(full scan)后采集20個碎片圖譜(MS2scan)，每個樣品重復3次，得到原始文件(raw file)。

1.3.6數據庫搜索和數據分析高效液相色譜-串聯(lián)質譜采集到的原始文件采用Bioworks Browser rev 3.1軟件查庫，搜索使用的數據庫為人類蛋白質數據庫3.53版本(http://www. ebi.ac.uk /IPI /IPI help.html)。鑒定參數設置為：蛋白酶為胰蛋白酶，最大允許丟失的酶切位點為2個，固定修飾為半胱氨酸的羧甲基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，前體離子的質量允差為3.0 u，片段離子的質量允差為0.0 u。SEQUEST蛋白質鑒定的結果過濾參數為：當Charge +1，Xcorr≥1.9；當Charge +2，Xcorr≥2.2；當Charge +3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。參考HE等[1]的報道，采用Buildsummary 4.7.0合并輸出鑒定的每個樣品蛋白質的信息，僅篩選基于一個或一個以上獨特肽段識別的蛋白質。

1.3.7搜索結果整合由于同源性肽段的存在，質譜鑒定的肽段可能指向多個蛋白，這時搜索結果將以一組同源性蛋白呈現(xiàn)，稱為一個蛋白群(protein group)。為避免過多的估計鑒定蛋白的數量，參考高峰等[2]的報道，采用如下原則來選擇其中一個蛋白作為代表：①如果肽段只對應一個蛋白，則選擇此“唯一”蛋白；②如果肽段對應多個同源性蛋白，選擇匹配肽段最多的蛋白作為這個群的代表；③如果有多個蛋白擁有最多的匹配肽段數，首先選擇SWISS-PROT和/或TREMBL數據庫鑒定的蛋白，因這兩個數據庫鑒定的蛋白可信度較高；④如果仍有多個蛋白滿足條件③，選擇分子量最大的蛋白作為這個群的代表。

2結果

2.1基本信息共收集得到尿液標本167份，經篩選獲得符合入組條件的標本98份。腎癌患者術前組、術后組尿液標本各32份，其中T1aN0M0期5例，T1bN0M0期18例，T2aN0M0期8例，T2bN0M0期1例。對照組尿液標本34份：其中腎積水12例，腎錯構瘤5例，腎盂惡性腫瘤4例，腎囊腫5例，腎結核2例，腎結石2例，健康志愿者3例。入組患者基本信息無明顯差異(表1)。

表1研究對象基本資料計數資料

組別n男[例(%)]年齡(x±s,歲)腎癌術前組3224(75.0)56.3±10.0腎癌術后組3224(75.0)56.3±10.0對照組3425(73.5)49.4±20.2χ2/F值0.0823.39P值0.950.16

2.2各組蛋白定量情況三氯醋酸-丙酮沉淀法成功提取了尿中蛋白質，BCA法測定不同稀釋倍數的標準品在562 nm處吸光度(A)值，繪制A-蛋白濃度標準曲線，得到標準曲線公式A=0.0375 Con(A：吸光度；Con：蛋白濃度，μg/uL；R2=0.9885)。將各待測樣品組A值代入標準曲線公式，計算得腎癌術前組、腎癌術后組、對照組蛋白濃度分別為32.79、9.15、26.57 ug/uL。

2.3各組蛋白SDS-PAGE電泳分離情況SDS-PAGE電泳分離發(fā)現(xiàn)各組樣品蛋白條帶清晰。整體上三組蛋白條帶分布相似，同時存在細微差別，在分子量14.4～32 ku之間差異較為明顯。各組在分子量64 ku附近均有大量蛋白表達，參考對照條帶此處蛋白可能為血清白蛋白，高豐度蛋白在腎癌術前組、對照組組表達更明顯，在腎癌術后組表達量相對較少(圖1)。

圖1　尿蛋白的SDS-PAGE初步分離結果及凝膠切開位置

2.4各組蛋白表達量高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析發(fā)現(xiàn)，腎癌術前組、腎癌術后組、對照組分別共鑒定獲得肽段4 388、3 501、3 861個，其中獨特肽段(UniquePep)分別727、679、753個，三組中獨特肽段數≥1的蛋白群分別有278、237、259個，獨特肽段數≥2的蛋白群分別有83、92、106個。

2.5腎癌特異性蛋白篩選對比分析各組蛋白表達情況發(fā)現(xiàn)，共鑒定獲得495個非冗余蛋白。其中96個蛋白在3組中共同表達，共表達蛋白分別占腎癌術前組、腎癌術后組、對照組蛋白數目的34.53%、40.51%、37.07%。除外這96個蛋白，另外有16、50、21個蛋白分別在腎癌術前組和腎癌術后組、腎癌術前組和對照組、腎癌術后組和對照組兩兩表達。腎癌術前組、腎癌術后組、對照組分別剩余的116、104、92個蛋白為本組特異性蛋白，分別占本組總蛋白數的41.73%、43.88%、35.52%。腎癌術前組特異表達的116個蛋白中獨特肽段數≥2的高可信蛋白共有5個，其中4個為免疫球蛋白類，一個為Lipocalin-2(LCN2)(圖2)。

圖2　各組蛋白集合關系模式圖(維恩圖)

Ⅰ：腎癌術前組特異表達蛋白(116個)；Ⅱ：腎癌術后組特異表達蛋白(104個)；Ⅲ：對照組特異表達蛋白(92個)；Ⅳ：腎癌術前組合對照組共同表達蛋白(50個)；Ⅴ：腎癌術前組和腎癌術后組共同表達蛋白(16個)；Ⅵ：腎癌術后組和對照組共同表達蛋白(21個)；Ⅶ：三組共同表達蛋白(96個)。

2.6各組蛋白理論雙向電泳分布分析發(fā)現(xiàn)鑒定蛋白相對分子量分布于3.56～3 829.88 ku。分布趨勢相對集中，在10～200 ku范圍內有717個蛋白(占總蛋白數的92.64%，含組間相同蛋白)，10 ku以下有5個蛋白，200 ku以上有52個蛋白。

鑒定蛋白等電點分布于4.06～11.88。3組中共有699個蛋白(占總蛋白數的90.31%，含組間相同蛋白)等電點分布于4～7和8～10之間，僅有56個蛋白(占總蛋白數的7.24%，含組間相同蛋白)等電點分布在7～8之間。

腎癌術前組、腎癌術后組、對照組分別有5、6、8個蛋白等電點>10。根據鑒定蛋白的分子質量和等電點信息，繪制各組蛋白理論雙向電泳分布圖(圖3),圖中可見各組鑒定蛋白理論雙向電泳分布總體趨勢相似，并且各組蛋白點具有一定的重疊，說明各組蛋白共同表達率較高，圖中直觀顯示了各組差異蛋白點。

圖3　鑒定蛋白理論雙向電泳(MW/PI)分布

3討論

尿液蛋白質表達譜復雜多變，尿液蛋白質組研究結果變異較大。選擇合適的蛋白質組研究策略、提高結果的可靠性是蛋白質組研究的首要問題。Shotgun蛋白質組學技術具有快速、簡單、高通量、自動化的特點。實驗過程操作無需經過復雜的雙向電泳，影響因素較傳統(tǒng)的2-DE策略顯著減少，因此結果可靠性更高。同時shotgun技術分析極堿、分子質量極小或極大的蛋白具有優(yōu)勢，本研究中腎癌術前組、腎癌術后組、對照組分別有5、6、8個蛋白等電點>10，3組中分子質量10 ku以下有5個蛋白，200 ku以上有52個蛋白，這些蛋白在傳統(tǒng)的2-DE策略中通常很難檢測到。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，腎癌術前組、腎癌術后組、對照組蛋白濃度分別為32.79、9.15、26.57 ug/uL。SDS-PAGE電泳分離發(fā)現(xiàn)各組均有不同程度的高豐度蛋白表達，在腎癌術后組高豐度蛋白表達量相對較少。對比SDS-PAGE中BSA條帶及結合蛋白鑒定結果，考慮高豐度蛋白為白蛋白(MW 69 ku)。正常情況下，腎小球濾過的白蛋白及低分子量蛋白在腎小管幾乎全部被重吸收或代謝掉，每天從尿液中排出的蛋白少于150 mg，其中白蛋白約10 mg[3]。白蛋白是尿液中的主要高豐度蛋白。在本研究中3組尿蛋白中白蛋白相對豐度較正常情況更高(圖1)，這可能是因為腎癌術前組患者及部分對照組患者存在不同程度的血尿，導致尿中以白蛋白為代表的高豐度蛋白高表達。腎癌術后患者血尿明顯減輕，尿中白蛋白含量銳減，所以腎癌術后組蛋白濃度低，高豐度蛋白表達也相對較少。

分析發(fā)現(xiàn)各組蛋白鑒定數目非常接近(腎癌術前組、腎癌術后組、對照組尿液中分別鑒定獲得278、237、259個蛋白)，蛋白數目與蛋白濃度之間缺乏相關性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定的蛋白大部分只檢測到一個肽段，為低豐度蛋白。這說明shotgun技術鑒定蛋白敏感性高，大量的低豐度蛋白被發(fā)現(xiàn)。這些低豐度蛋白總體濃度不高，但在數量上占優(yōu)勢，而濃度占優(yōu)的以白蛋白為首的高豐度蛋白在數量上有限，所以出現(xiàn)蛋白濃度與數目不一致的情況。

各組蛋白的分子量、等電點分布范圍廣泛又相對集中，主要分布于分子質量10～100 ku、等電點4～7和8～10之間。各組蛋白質分子質量、等電點分布規(guī)律與SUN等[4]通過3種不同分離方法分析尿蛋白質組的研究結果一致。

尿液在形成過程中流經腎小管上皮，腎小管上皮細胞可分泌一種叫做外排小體(exosome)的微囊，這些微囊包含的蛋白構成尿蛋白的重要組成部分[5]。腎小管上皮細胞在由正常分化細胞逐步轉化為腎癌細胞的過程中以及腎癌形成后，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系密切的重要分子很容易通過胞吐外排小體的形式進入尿液。同時血液中的腎癌標志物也可通過腎小球過濾進入尿液。當腎癌生長到一定程度后，還可侵犯集合系統(tǒng)，腫瘤相關分子更容易直接進入尿液。尿液中可能富含腎癌標志物[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，有116個蛋白在腎癌術前組尿液中特異表達，這些蛋白中可能有重要的腎癌標志物。分析發(fā)現(xiàn)，獨特肽段數≥2的蛋白有5個，這些蛋白為高可信蛋白。其中4個為免疫球蛋白類，推測可能與腎癌誘導的機體免疫有關，另一個高可信蛋白為LCN2。

LCN2又稱中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，分子質量25 ku。LCN2最初在活化的中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)其他很多細胞也可產生LCN2，如腎小管上皮細胞受到各種創(chuàng)傷因素的刺激后可釋放LCN2。LCN2是載脂蛋白家族成員之一，擁有一個保守的三級結構，即由8個反平行折疊形成的桶狀親脂性結構，借此結構可與一些親脂小分子結合而形成復合物，在親脂小分子的轉運中發(fā)揮作用。LCN2還可以通過二硫鍵結合基質金屬蛋白酶9(MMP9)，調節(jié)MMP9酶活性，同時還參與相關細胞膜受體介導的鐵離子跨膜轉運。

LCN2在多種腫瘤中高表達，與腫瘤細胞發(fā)生、增殖、凋亡、侵襲、轉移、預后等關系密切。張秀峰等[7]發(fā)現(xiàn)LCN2在乳腺癌中高表達。MONIAUX等[8]發(fā)現(xiàn)LCN2在胰腺癌高表達，在健康胰腺組織中低表達，但在胰腺癌PanIN-1期即有LCN2表達，提示LCN2可能為胰腺癌早期標志物。BERGER等[9]發(fā)現(xiàn)敲出小鼠LCN2基因可使乳腺癌成瘤受抑制。帖儒修等[10]發(fā)現(xiàn)LCN2基因表達產物可促進人胚腎HEK293細胞增殖。TONG等[11]發(fā)現(xiàn)LCN2表達上調可降低肺腺癌A549對凋亡的敏感性，表達下調則能促進OSU03012誘導的細胞凋亡發(fā)生。張丕顯等[12]發(fā)現(xiàn)LCN2蛋白可誘導食管癌細胞發(fā)生自噬性凋亡。BAUER等[13]分析207例乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)68例表達LCN2，是預后不良的標志分子。

近年來LCN2與腎癌的關系也有報道。2010年BARRESI等[14]通過免疫組化分析30例手術切除的腎臟腫瘤標本(包括18例ccRCC，5例paRCC，3例chRCC，2例尿路上皮癌和2例大嗜酸粒細胞瘤)和2例ccRCC腹膜轉移癌，結果發(fā)現(xiàn)其中28例有不同程度的LCN2表達，尤其高表達在paRCC、chRCC及病理分級較高的ccRCC高表達。在腹膜轉移癌中也同樣發(fā)現(xiàn)LCN2表達。2010年PORTA等[15]發(fā)現(xiàn)血清LCN2水平是接受舒尼替尼治療的轉移性腎癌患者無進展生存期的重要預后因子。2011年PERRIN等[16]在一項包含74例ccRCC患者的研究中發(fā)現(xiàn)，血清NGAL-MMP-9復合物濃度與患者的無進展生存期和總生存期呈負相關，LCN2表達于腎癌組織浸潤的白細胞中。2013年SHALABI等[17]通過尿LCN2檢測用于腎細胞癌不同亞型的鑒定。2014年YU等[18]研究發(fā)現(xiàn)腎癌細胞中LCN2表達水平與對舒尼替尼治療敏感性呈負相關，LCN2可通過作用于血管內皮生長因子A進而促進腎癌細胞增殖。

結合本研究結果及前人的報道，LCN2可能在腎癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用，其具體作用機制目前尚不清楚，值得深入研究。LCN2可能是尿液中腎癌重要的標志物，尿LCN2檢測對腎癌早期診斷的意義也值得進一步研究。

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(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-05-19修回日期：2015-08-09

通訊作者:王子明，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導師.

作者簡介:付德來(1981-)，男(漢族)，醫(yī)學博士.研究方向：泌尿系腫瘤的基礎與臨床、尿道狹窄. E-mail：fudelai@126.com

中圖分類號:R737.11

文獻標志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.015

Screening urinary markers for renal cell carcinomaby shotgun strategy

FU De-lai1, CHONG Tie1, LI He-cheng1, ZHANG Peng1, LIU Hong-tao2, WANG Zi-ming1

(1.Department of Urology，2. Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate potential urinary protein markers of renal cell carcinoma (RCC). MethodsMiddle stream samples of 2nd morning urine from RCC patients, pre-operatively and post-operatively, and from non-RCC patients were collected. Urine proteins were extracted and separated by SDS-PAGE, digested by trypsin and further analyzed by Capillary High Performance Liquid Chromatography ESI-MS/MS. Results were integrated and conducted for bioinformatic analysis with Bioworks Browser rev 3.1 in searching SWISS-PROT and/or TREMBL human proteome database. ResultsFor pre-operative (n=32), post-operative (n=32) and control (n=34) urine samples, the protein concentration was 32.79, 9.15 and 26.57 μg/μL; 727, 679, and 753 unique peptides were detected; 278, 237, and 259 protein clusters were identified under the criterion of uniquepepcount ≥1; and 83, 92, and 106 protein clusters were found under the criterion of uniquepepcount ≥2. A total of 5 proteins (namely LCN2 and 4 immune globulins) were specifically expressed in pre-operative group. ConclusionsLCN2 is specifically expressed in urine of RCC patients. The role of LCN2 in the occurrence and development of RCC and its potency as urinary marker for RCC is worthy of further investigation.

KEY WORDS:renal cell carcinoma; marker; urine; proteome

E-mail：ziming-w@263.net