經(jīng)語佳　高　健　王夢芝　何躍楠　史良峰　歐陽佳良

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009)

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不同長鏈脂肪酸組合對體外瘤胃細菌發(fā)酵和群體結構的影響

經(jīng)語佳高健王夢芝*何躍楠史良峰歐陽佳良

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009)

摘要：本試驗旨在研究不同長鏈脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃細菌發(fā)酵和群體結構的影響。以3頭瘤胃瘺管奶牛提供瘤胃液，對照(A)組底物含5%脂肪酸鈣，試驗組培養(yǎng)底物中硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的含量分別為1.5%、1.0%、0.5%和1.5%(B組)，1.5%、1.0%、1.5%和1.0%(C組)，1.0%、1.5%、1.5%和0.5%(D組)以及1.5%、0.5%、0.5%和1.0%(E組)。在培養(yǎng)后0、3、6、12、18、24 h采集培養(yǎng)液，測定pH、氨氮濃度和瘤胃細菌含量。結果表明：1)培養(yǎng)液pH在組間的差異不顯著(P>0.05)；C組的培養(yǎng)液氨氮濃度顯著高于B、D組(P<0.05)。2)除白色瘤胃球菌，其他菌屬含量在組間存在顯著差異(P<0.05)。其中琥珀酸擬桿菌、生黃瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌和嗜淀粉瘤胃桿菌含量在B組較高；C組溶纖維丁酸弧菌、埃氏巨球菌、降解淀粉瘤胃球菌以及瘤胃總細菌含量顯著高于其他各組(P<0.05)。培養(yǎng)液埃氏巨球菌含量最高，為優(yōu)勢菌。綜合得出，脂肪酸組合對瘤胃總細菌和大部分細菌種屬含量有顯著影響，這與發(fā)酵模式有關。

關鍵詞：脂肪酸組合；瘤胃；細菌；群體結構

反芻動物瘤胃微生物主要由細菌、原蟲、古菌和真菌等組成[1-2]，其群體數(shù)量和結構與宿主動物機體的健康狀況、飼料利用率、生產(chǎn)性能等密切相關[3]。油脂飼料可通過調控瘤胃微生物各群系的量、原蟲吞噬細菌或古菌的互作等來影響瘤胃微生物群體數(shù)量及其結構，進而影響瘤胃發(fā)酵，最終影響宿主的飼料利用性能和生產(chǎn)性能。有研究報道，羊草底物條件下添加5%和10%的亞麻籽油顯著降低了瘤胃微生物發(fā)酵的產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量，提高了氫氣產(chǎn)量[4]。而體外培養(yǎng)飽和度不同的植物油脂對培養(yǎng)液酶活、微生物活力[5]、瘤胃原蟲、細菌蛋白及DNA[6]都有一定的影響。進一步對脂肪酸的研究表明，不同比例亞油酸與亞麻酸影響人工瘤胃體外發(fā)酵和其甲烷的生成，且隨亞麻酸比例的升高效應增強[7]；而且不同的脂肪酸對瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生乙酸和丙酸的量也有不同的影響[8]。我們前期6種不同長鏈脂肪酸的試驗表明，飽和程度對瘤胃微生物的發(fā)酵模式有一定的調控作用[9]，通過正交試驗篩選出了對瘤胃微生物發(fā)酵模式(乙酸型發(fā)酵、丙酸型發(fā)酵、丁酸型發(fā)酵等)適宜的脂肪酸組合。但這些組合是否通過影響瘤胃細菌群體結構的機制來影響其發(fā)酵模式的尚不得而知。為此，本試驗采用所篩選的脂肪酸組合進行瘤胃微生物的體外培養(yǎng)試驗，通過檢測不同瘤胃細菌種屬的含量，以期為研究闡明脂肪酸影響反芻動物瘤胃微生態(tài)機理提供一些基礎資料。

1材料與方法

1.1試驗動物與飼養(yǎng)管理

在揚州大學實驗農(nóng)牧場的奶牛場選取選3頭體重為(560±18) kg、平均產(chǎn)奶量為(15.5±0.5) kg并安裝有瘤胃瘺管的4歲齡荷斯坦奶牛以提供瘤胃液。試驗期間瘺管牛飼喂給奶牛場提供的常規(guī)飼糧(精粗比為40∶60)，每日07:00和19:00等量飼喂，自由飲水。

1.2試驗設計與培養(yǎng)底物

本課題組前期對于瘤胃微生物發(fā)酵調控具有代表性的4種脂肪酸(硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻油酸)進行體外模擬瘤胃發(fā)酵技術培養(yǎng)瘤胃微生物，研究獲得了對于瘤胃乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸發(fā)酵最優(yōu)的組合。根據(jù)得到最優(yōu)脂肪酸組合比例，設計為5組。A組：對照組，培養(yǎng)底物含5%棕櫚酸鈣；B、C、D、E組培養(yǎng)底物采用硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的不同比例組合：B(1.5%、1.0%、0.5%和1.5%，乙酸型發(fā)酵)、C(1.5%、1.0%，1.5%和1.0%，丙酸型發(fā)酵)、D(1.0%、1.5%、1.5%和0.5%，丁酸型發(fā)酵)、E組(1.5%、0.5%、0.5%和1.0%，總揮發(fā)性脂肪酸型發(fā)酵)。其中不足5%者由棕櫚酸鈣補足5%。每組各設3個重復，另外設1個無底物的空白對照。培養(yǎng)底物組成見表1。

表1　體外培養(yǎng)底物的組成Table 1　Composition of in vitro culture substrates　%

1.3體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)參照Menke等[10]的方法。晨飼前通過瘤胃瘺管從3頭瘺管奶牛采集瘤胃液，按人工唾液鹽∶瘤胃液=2∶1配制好培養(yǎng)液，通CO239 ℃水浴預熱備用。準確稱取各組1.50 g底物置于培養(yǎng)瓶中，分別加入150 mL培養(yǎng)液，通CO239 ℃ 50 r/min振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)后0、3、6、12、18、24 h分別采集培養(yǎng)液待測。

1.4引物設計

在GenBank上查找琥珀酸擬桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、生黃瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)等不同菌株的16S rDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign進行序列比對，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer express 5.0進行引物設計，并通過GenBank中Blast檢測引物特異性。以細菌通用引物細菌U(Bacterial-U)為內(nèi)參，對各細菌進行相對定量。細菌引物序列見表2。

表2　細菌引物信息與序列表Table 2　PCR primers sequence of bacteria

1.5指標測定

采用上海雷磁pHS-3C型酸度計即時測定樣品pH；采用馮宗慈等[11]的方法測定氨氮濃度。瘤胃細菌DNA參照Zoetendal等[12]的珠磨法提取，采用實時定量PCR(RT-PCR)法在7500型RT-PCR儀上進行定量檢測。

1.6微生物含量計算

采用相對定量法定量各菌，根據(jù)如下公式計算：

目標菌含量=2-(Ct目標菌-Ct總細菌)。

式中：Ct目標菌為目標菌循環(huán)閾值；Ct細菌U為細菌U循環(huán)閾值。

1.7統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0軟件中的General Linear Model的Univariate方法進行統(tǒng)計分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2結果

2.1不同脂肪酸組合對培養(yǎng)液pH的影響

表3表明，培養(yǎng)液pH在6.02～6.52的范圍內(nèi)變化。不同脂肪酸組合的影響不顯著(P>0.05)；但時間的影響顯著(P<0.05)，以培養(yǎng)后3 h的pH最高。時間和脂肪酸組合對pH有顯著的互作效應(P<0.05)，表現(xiàn)為：各組pH都在0～3 h間上升、在3～12 h間下降，其變化趨勢比較一致；但在12～18 h間除A組外皆有所下降，在18～24 h間A、B組下降，而C、D、E組上升。

2.2不同脂肪酸組合對培養(yǎng)液氨氮濃度的影響

表4表明，培養(yǎng)液氨氮濃度在7.91～17.05 mg/dL范圍內(nèi)變化。其中，脂肪酸組合的影響顯著(P<0.05)，以C組最高；時間的影響也顯著(P<0.05)，以0、3 h較低。時間和脂肪酸組合對氨氮濃度有顯著的互作效應(P<0.05)，表現(xiàn)為：在培養(yǎng)后0～3 h間，除A組下降外其他各組皆上升；在3～6 h間，除D組下降外其他各組皆上升；在6～12 h間，除B組上升外其他各組皆下降；在12～18 h間，除C組下降外其他組皆上升；18～24 h間，A、E組下降而B、C、D組上升。

表3　不同脂肪酸組合對培養(yǎng)液pH的影響Table 3　Effects of different fatty acid combinations on pH of culture medium

平均值數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表4同。

Means with different letter superscripts differed significantly (P<0.05). The same as Table 4.

表4　不同脂肪酸組合對培養(yǎng)液氨氮濃度的影響Table 4　Effects of different fatty acid combinations on NH3-N concentration of culture medium　mg/dL

2.3不同脂肪酸組合對培養(yǎng)液瘤胃細菌含量的影響

表5表明，除白色瘤胃球菌含量在組間沒有顯著差異(P>0.05)外，其他種屬細菌含量組間存在顯著差異(P<0.05)。其中，琥珀酸擬桿菌、生黃瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的含量均以B組的較高。溶纖維丁酸弧菌和降解淀粉瘤胃球菌含量以C組較高，顯著高于其他各組(P<0.05)。而埃氏巨球菌含量以A組最低，顯著低于最高的C組(P<0.05)。

各種所測定的細菌含量之間存在顯著差異(P<0.05)。其中，埃氏巨球菌含量最高(8.45)為優(yōu)勢菌屬；而白色瘤胃球菌(0.27)和生黃瘤胃球菌含量(0.44)相對較低。以所測得的種屬計瘤胃總細菌含量，則以C組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

不同組數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，平均值數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Values of different groups with different letter superscripts differed significantly (P<0.05), and means with different letter superscripts differed significantly (P<0.05).

3討論

3.1不同脂肪酸組合對瘤胃細菌體外發(fā)酵的影響

本試驗中，培養(yǎng)液pH的變化范圍(6.02～6.52)不大且適宜于瘤胃微生物的生長。該結果與前人關于油脂或脂肪酸的試驗結果有一定的一致性。體外培養(yǎng)瘤胃微生物，宋志剛等[13]在培養(yǎng)液中添加4%的飽和程度不同的4種油脂，沒有顯著影響pH；皮宇等[14]添加3%的飽和程度不同的6種脂肪酸，pH的差異也不顯著。本試驗中，氨氮濃度在7.91～17.05 mg/dL范圍變化，也屬于瘤胃微生物的發(fā)酵代謝與生長的適宜濃度范圍[15]。但氨氮濃度在脂肪酸組合組間差異顯著，并以C組較高而D組較低，C組>E組>B組>D組。由于本研究的脂肪酸組合處理B、C、D、E組的不飽和程度依次為0.92、1.00、0.50、0.71，即C組>B組>E組>D組，氨氮濃度高低順序與處理的不飽和程度基本一致。其原因之一可能是隨著不飽和程度的降低，其對瘤胃原蟲群體量[16-17]和其吞噬細菌活力的抑制效應增加[18]，相應地，其細菌的數(shù)量將增加、發(fā)酵活力將增強，進而可能導致了氨氮濃度的升高。這也與本試驗中所測得的總細菌含量的排序C組>B組>E組>D組基本一致。綜合這些結果說明，不同的脂肪酸組合處理是通過影響了瘤胃細菌的群體進而影響其發(fā)酵的。另外，從時間的分析可見，C組氨氮濃度平均值較高主要歸因于在3～12 h期間細菌發(fā)酵活力增強導致的氨氮濃度高于D組；相反，在18～24 h期間細菌生長活力增強利用氨氮也增加導致了氨氮濃度低于D組。

3.2不同脂肪酸組合對體外培養(yǎng)瘤胃細菌的影響

目前多數(shù)的報道是添加某種特殊的油脂或脂肪酸對瘤胃細菌的影響，系統(tǒng)探討多種脂肪酸及其組合效應的研究并不多見，而本研究即是在前期篩選出對不同發(fā)酵模式最優(yōu)的脂肪酸組合基礎上再在進一步探討其對瘤胃細菌的影響。本試驗中，C組的總細菌含量最高，這與上述其不飽和度較高有關，也有可能和其脂肪酸間的組合效應有關。而與此同時，C組的溶纖維丁酸弧菌在組間也為最高。分析其原因，一方面是因為溶纖丁弧菌多棲居于液相[19]，而原蟲也多吞噬為液相的0.2～1.0 μm大小的桿菌和球菌，而該組的不飽和鍵又對原蟲吞噬力有一定的抑制所致；另一方面，也可能是由于該組合適量不飽和油脂(亞油酸)的添加，促進了該菌的繁殖以及其氫化功能[20]。Lee等[21]也曾報道，添加不飽和油脂(魚油)提高了亞油酸的生物氫化量。溶纖維丁酸弧菌在瘤胃中代謝底物廣泛，主要發(fā)酵產(chǎn)物是丁酸和乳酸；同時該菌與埃氏巨型球菌、反芻獸新月單胞菌等交互飼喂，維持瘤胃液pH的穩(wěn)定。其所產(chǎn)生的乳酸可由乳酸利用菌埃氏巨型球菌所利用，并通過丙烯酰輔酶A途徑生成丙酸[22]。而本研究同時發(fā)現(xiàn)埃氏巨型球菌含量在C組也是最高的，為此可在一定程度上解釋C組是發(fā)酵后丙酸含量最高的脂肪酸組合。

降解淀粉瘤胃球菌也多棲居于瘤胃液相，由于主要以淀粉為代謝底物，是高精料、低pH條件下相對活躍的菌屬。如降解淀粉瘤胃球菌在瘤胃液pH較低的條件下含量較高[23]。關于飼糧，添加豆油和胡麻油的研究并沒有發(fā)現(xiàn)肉牛瘤胃淀粉分解菌的變化[24]，但在本研究卻發(fā)現(xiàn)C組的降解淀粉瘤胃球菌含量最高。這可能是由于該組不飽和程度較高使得原蟲對液相菌的吞噬下降所致。同時，該菌的提高及其與其他菌屬的交互飼喂也可能導致淀粉終代謝產(chǎn)物之一的丙酸含量的增加，而這在一定程度上說明，本組適合丙酸型發(fā)酵的脂肪酸組合可能是通過提高降解淀粉瘤胃球菌含量來實現(xiàn)的。嗜淀粉瘤胃桿菌也是瘤胃中淀粉降解菌之一，其主要產(chǎn)物為乙酸和琥珀酸[25]。本試驗中該菌以B組最高，這在一定程度上解釋了B組為乙酸型發(fā)酵的脂肪酸組合；同時，嗜淀粉瘤胃桿菌也是瘤胃中主要的蛋白質降解菌之一，可將蛋白質降解為氨氮和氨基酸，并成為其生長的底物[26-27]。結合氨氮濃度的結果發(fā)現(xiàn)，B組的氨氮濃度在培養(yǎng)后呈持續(xù)增長的趨勢，這與該菌含量較高相吻合。這一結果同時也與王夢芝等[28]的研究中該菌在瘤胃液氨氮濃度高的豆粕飼糧中含量較高的結果相一致。

生黃瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等降解纖維素類物質降解菌主要棲居于瘤胃固相，其發(fā)酵產(chǎn)物以乙酸為主。例如，高纖維素飼糧提高了牛瘤胃生黃瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌數(shù)量[29]。本研究中，生黃瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌含量都在B組較高。其中，生黃瘤胃球菌含量在B組提高的結果與金龍等[30]體外發(fā)酵添加4%的棕櫚仁油提高了生黃瘤胃球菌含量的結果一致；但產(chǎn)琥珀酸擬桿菌含量在B組提高的結果與烏日娜[31]添加6%的植物油脂時顯著降低了瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的結果有所不同。這可能是由于油脂添加超過一定比例時，因附著于瘤胃中纖維素和菌體表面，影響細菌的活動及其酶的分泌；或損害部分纖維素降解微生物的胞膜而抑殺微生物有關[32]。本研究中B組這2種菌屬含量的提高，與上述該組嗜淀粉瘤胃桿菌含量較高等結果一致，這說明B組的脂肪酸組合可能是通過影響瘤胃細菌組成來進一步提高其乙酸發(fā)酵的。但在本研究中，B組白色瘤胃球菌含量并沒有顯著增加，這和金龍等[30]添加4%椰子油或棕櫚仁油不影響白色瘤胃球菌含量結果一致。有研究認為，白色瘤胃球菌含量所產(chǎn)生的抗菌素可抑制生黃瘤胃球菌的生長[33]。進一步探討本試驗中試驗組白色瘤胃球菌含量排序為D組>C組>E組>B組，而生黃瘤胃球菌含量為B組>E組>C組>D組，不難發(fā)現(xiàn)，2種菌屬的含量排序相反，提示它們間可能存在一定的互抑作用，有關其互抑機制尚有待于進一步地探索。

4結論

① 體外培養(yǎng)添加不同脂肪酸組合，培養(yǎng)液pH和氨氮濃度都在適宜范圍內(nèi)變化，但其瘤胃總細菌和部分細菌種屬含量有顯著變化，這與發(fā)酵模式有關。

② 培養(yǎng)底物中硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸含量分別為1.5%、1.0%、0.5%和1.5%時，培養(yǎng)液琥珀酸擬桿菌、生黃瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌和嗜淀粉瘤胃桿菌含量較高。

③ 培養(yǎng)底物中硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸含量分別為1.5%、1.0%，1.5%和1.0%時，培養(yǎng)液溶纖維丁酸弧菌、降解淀粉瘤胃球菌和埃氏巨球菌含量較高。

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(責任編輯王智航)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.035

收稿日期：2016-01-28

基金項目：江蘇省2016年蘇北專項(富民強縣)項目；江蘇省自然科學基金基礎研究項目(BK20151312)；江蘇省優(yōu)勢學科(PAPD)

作者簡介：經(jīng)語佳(1992—)，女，江蘇江都人，碩士研究生,動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E-mail: 873432484@qq.com *通信作者：王夢芝，副教授，碩士生導師，E-mail: mengzhiwangyz@126.com

中圖分類號：S823

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)07-2278-08

*Corresponding author, associate professor, E-mail: mengzhiwangyz@126.com

Effects of Different Long-Chain Fatty Acid Combinations on Ruminal Bacterial Fermentation and CommunityinVitro

JING YujiaGAO JianWANG Mengzhi*HE YuenanSHI LiangfengOUYANG Jialiang

(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract:This experiment was conducted to investigate the effects of different long-chain fatty acid combinations on ruminal bacterial fermentation and community in vitro. Three cows fitted with permanent ruminal cannulas were used to provide rumen liquor for the in vitro trail. The substrate of control (A) group contained 5% fatty acid calcium, and the substrates of experimental groups contained stearic acid, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid by the following contents: 1.5%, 1.0%, 0.5% and 1.5% (B group), 1.5%, 1.0%, 1.5% and 1.0% (C group), 1.0%, 1.5%, 1.5% and 0.5% (D group), 1.5%, 0.5%, 0.5% and 1.0% (E group). Culture medium was collected for the measurements of pH, ammonia nitrogen concentration and rumen bacterial contents at 0, 3, 6, 12, 18 and 24 h after fermentation. The results showed as follows: 1) no significant difference was found in pH of culture medium (P>0.05); ammonia nitrogen concentration in C group was significantly higher than that in B and D groups (P<0.05). 2) Significant differences could be find in all bacterial genus except Ruminococcus albus (P<0.05). B group was higher in the contents of Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Clostridium proteoclasticum and Ruminobacter amylophilus; while group C was significantly higher in the contents of Butyrivibrio fibrisolvens, Megasphaera elsdenii, Ruminococcus bromii and total bacterial than the other groups (P<0.05). Megasphaera elsdenii was the dominant bacterial genus with the highest content. In conclusion, fatty acid combination has remarkable effects on the contents of rumen total bacteria and most bacterial genus, which is relate to rumen fermentation mode.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2278-2285]

Key words:fatty acid combination; rumen; bacteria; community