NLRP3在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義

湯俊照，汪亦品

(1.宣城市中心醫(yī)院　五官科，安徽　宣城　242000；2.南京醫(yī)科大學(xué)　病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇　南京　210029)

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·臨床醫(yī)學(xué)·

NLRP3在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義

湯俊照1，汪亦品2

(1.宣城市中心醫(yī)院五官科，安徽宣城242000；2.南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇南京210029)

【摘要】目的：探討炎癥小體NLRP3在鼻咽癌組織和正常鼻咽黏膜組織中的表達(dá)水平變化及其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化檢測(cè)40例鼻咽癌組織和12例正常鼻咽黏膜組織中NLRP3的表達(dá)水平。結(jié)果：①NLRP3在鼻咽癌組織中表達(dá)顯著高于正常鼻咽黏膜組織 (P<0.05)；②在鼻咽癌患者中，NLRP3的表達(dá)水平與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的臨床預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，NLRP3高表達(dá)患者較低表達(dá)患者具有更好的局部無復(fù)發(fā)生存率和無瘤生存率，但與年齡和組織病理類型無明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論：NLRP3具有提示鼻咽癌腫瘤轉(zhuǎn)移及判斷患者預(yù)后的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】NLRP3；腫瘤轉(zhuǎn)移；鼻咽癌；LRSF/DSF

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.021

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種侵襲性強(qiáng)的惡性腫瘤，惡性程度高，早期易發(fā)生淋巴結(jié)和全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有相當(dāng)高的病死率，但其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前尚不是很清楚[1]。

近年來，炎癥-腫瘤的相關(guān)研究已成為腫瘤學(xué)研究重點(diǎn)，流行病學(xué)已證實(shí)至少25% 的人類惡性腫瘤與炎癥和慢性感染有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，致炎因子水平升高與卵巢癌、頭面部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等各種腫瘤密切相關(guān)[3-6]。鑒于此,本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)40例鼻咽癌組織和12例正常鼻咽黏膜組織中NLRP3的表達(dá)水平，旨在探討NLRP3的表達(dá)水平與鼻咽癌之間的關(guān)系。

1資料與方法

1.1臨床資料收集宣城市中心醫(yī)院病理科2000年10月～2010年7月外科手術(shù)切除和存檔的鼻咽癌組織40例，所有標(biāo)本均常規(guī)經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋。40例患者中，男28例，女10例；年齡23～62歲，中位年齡43歲。按福州會(huì)議[7]進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期5例、Ⅱ期13例、Ⅲ期16例、Ⅳ期6例；復(fù)發(fā)22例，無復(fù)發(fā)18例；中位隨訪時(shí)間60.5月，隨訪期間死亡6例。所有病例病理活檢前均未行任何治療。對(duì)照組12例正常鼻咽黏膜組織來自我院同期體檢病例。52例中7例組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.2免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化染色SP法，按試劑盒操作步驟進(jìn)行染色。NLRP3兔抗人多克隆抗體購自北京博鰲森生物技術(shù)公司，稀釋度1∶50；SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自杭州碧云天生物技術(shù)公司。光鏡下腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色著色者判定為陽性，并用0、1、2和3分別代表陰性、弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性。蛋白表達(dá)量由陽性信號(hào)著色強(qiáng)度的量化得分進(jìn)行判定，其中弱陽性代表低表達(dá)，中等陽性、強(qiáng)陽性代表高表達(dá)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR采用Primer 3.0在線設(shè)計(jì)來設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，遵循跨內(nèi)含子的原則，以避免非特異性及引物二聚體產(chǎn)生，委托上海Invitrogen公司合成(見表1)。

表1PCR引物序列

名稱引物序列GAPDHF:5'-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3'R:5'-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3NLRP3F:5'-GTGGTGACCCTCTGTGAGGT-3'R:5'-TCTTCCTGGAGCGCTTCTAA-3'

采用TRIZOL一步法抽提細(xì)胞及組織的總RNA，取1 μg總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR green 實(shí)時(shí)定量PCR方法，反應(yīng)體系為25 μL，置于ABI PRISM 7500熒光定量PCR 儀中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃，10 min；隨后以95 ℃，15 s 和60 ℃，1 min循環(huán)40次。 采用參照基因的 Ct 法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，采用相對(duì)定量法計(jì)算各基因mRNA 表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床病理類型采用Fisher精確概率法檢驗(yàn)，生存曲線使用Kaplan-Meier 法進(jìn)行繪制，兩組間比較用t檢驗(yàn)；Cox危險(xiǎn)因素模型用多因素方差分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1炎癥小體NLRP3在鼻咽癌組織中表達(dá)升高免疫組化顯示NLRP3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，偶見于細(xì)胞核(圖1A、B)。NLRP3在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)明顯高于正常鼻咽黏膜組織(升高近6倍)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同樣，實(shí)時(shí)定量PCR顯示鼻咽癌組織中NLRP3表達(dá)量較正常組織升高近4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A：NLRP3在NPC和正常組織中的表達(dá)；上圖為代表性免疫組化圖片，下圖為免疫組化陽性評(píng)分。B：實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)鼻咽癌和正常鼻黏膜組織中NLRP3的表達(dá)(*P<0.05,n=7)。

圖1NLRP3在鼻咽癌組織中的表達(dá)

2.2鼻咽癌組織中NLRP3的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示腫瘤組織中NLRP3高表達(dá)患者較低表達(dá)患者具有更好的局部無復(fù)發(fā)生存率(local recurrence-free survival,LRFS)和無瘤生存率(disease-free survival，DFS)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A、B)。

2.3鼻咽癌組織中NLRP3表達(dá)水平與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系鼻咽癌組織中NLRP3的表達(dá)水平與腫瘤臨床病理類型、患者年齡無明顯相關(guān)性，而和腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05，表2)。

表2鼻咽癌組織中NLRP3表達(dá)水平與各臨床參數(shù)的關(guān)系

類別例數(shù)NLRP3表達(dá)水平高低P年齡/歲0.751 ≤45221012 >4518108組織類型1.000 基底樣細(xì)胞鱗癌734 未角化癌331716淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移<0.001 有16142 無24618

A：Kaplan-Meier 生存曲線分析鼻咽癌患者腫瘤組織中炎癥小體NLRP3的表達(dá)水平高低與患者LRFS之間的關(guān)系。 B：Kaplan-Meier生存曲線分析鼻咽癌患者腫瘤組織中炎癥小體NLRP3的表達(dá)水平高低與患者DFS之間的關(guān)系。

圖2鼻咽癌組織中NLRP3表達(dá)水平高低與LRFS和DFS的關(guān)系

3討論

炎癥是機(jī)體受到多種體內(nèi)外因素刺激后產(chǎn)生的局部或全身性應(yīng)答反應(yīng)，也是機(jī)體針對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答和損傷修復(fù)的重要機(jī)制。許多研究表明，炎癥細(xì)胞及其因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和免疫逃逸等方面的促進(jìn)作用遠(yuǎn)大于其本身的抗腫瘤效應(yīng)，對(duì)炎癥-腫瘤相互關(guān)系的研究是人類惡性腫瘤研究中十分重要的環(huán)節(jié)[8]。

炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)大分子量的多蛋白復(fù)合體，由類型識(shí)別受體(如NLRP3、NLRC4、AIM2等)、接頭蛋白ASC及caspase-1組成[9]，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎癥小體能識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)[10]或者宿主來源的危險(xiǎn)信號(hào)分子(DAMPs)[11]。炎性小體能夠調(diào)節(jié)半胱天冬肽酶-1(caspase-1)的活化進(jìn)而在天然免疫防御的過程中促進(jìn)細(xì)胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12-13]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)是最具代表性的炎癥小體。NLRP3炎癥小體在很多疾病中都發(fā)揮重要作用。Zhou等發(fā)現(xiàn)高濃度的葡萄糖能刺激胰島細(xì)胞激活 NLRP3炎癥小體,產(chǎn)生 IL-1β，引發(fā)炎癥反應(yīng)[14]。在腫瘤研究中，人們發(fā)現(xiàn)，NLRP3通過剪切糖皮質(zhì)激素受體而誘導(dǎo)急性白血病(ALL)的糖皮質(zhì)激素抵抗[15]。而在結(jié)腸癌[16]、膠質(zhì)瘤[17]中，NLRP3炎癥小體可抑制腫瘤的遷移及增值，表現(xiàn)出了組織差異性。

目前NLRP3在鼻咽癌中的角色尚不十分清楚。本研究通過對(duì)40例有臨床隨訪資料的NPC患者進(jìn)行分析，NLRP3在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，表明NLRP3可能參與了NPC腫瘤的發(fā)生。我們知道，NPC治療的最大障礙是腫瘤極易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后普遍較差。預(yù)防、預(yù)測(cè)并抑制NPC的轉(zhuǎn)移對(duì)改善NPC患者的生存率無疑是非常關(guān)鍵的。而目前NLRP3與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系卻不清楚。本研究中，我們通過對(duì)NLRP3的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床各參數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中NLRP3的表達(dá)顯著低于無轉(zhuǎn)移的患者。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中炎癥小體蛋白NLRP3表達(dá)水平高低與患者的LRSF和DSF具有明顯的相關(guān)性，NLRP3越高，LRSF和DSF越好，提示NLRP3參與了腫瘤的進(jìn)展過程，在局部腫瘤組織中過表達(dá)炎癥小體NLRP3可能起到控制腫瘤的作用。但NLRP3的水平高低卻與患者年齡和腫瘤的病理類型無明顯相關(guān)性。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了NLRP3可能在NPC腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可作為獨(dú)立的良好預(yù)后分子標(biāo)志物，為腫瘤提供有效的治療靶點(diǎn)。

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文章編號(hào)：1002-0217(2016)04-0374-04

收稿日期：2015-11-22

作者簡(jiǎn)介：湯俊照(1981-)，男，住院醫(yī)師，(電話)18956308352，(電子信箱)285127072@qq.com;

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 739.63A

NLRP3 expression and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

TANG Junzhao,WANG Yipin

Department of ENT,Xuancheng Central Hospital,Xuancheng 242000,China

【Abstract】Objective：To determine the expression level change of inflammasome NLRP3 in tissues of nasopharyngeal carcinoma(NPC) and normal nasopharyngeal mucosa,and investigate the level change with clinical prognosis.Methods:Real-time quantitative PCR and immunohistochemistry techinqe were used to detect NLRP3 expression level in 40 patients with NPC and in 12 subjects with normal nasopharyngeal mucosa.Results:①The NLRP3 expression was significantly higher in NPC tissue than that in normal nasopharyngeal mucosa(P<0.05);②Expression level of NLRP3 was correlated with lymph node metastasis of the tumor and clinical prognosis in patients with nasopharyngeal cancer(P<0.05).Although patients with higher NLRP3 expression level had better local recurrence-free survival (LRFS) and disease-free survival (DFS),yet NLRP3 level had no obvious correlation with patients′ age and histopathologic types of tumor (P<0.05).Conclusion:Inflammasome NLRP3 is better indicative of tumor metastasis and prognosis for patients of NPC,and higher NLRP3 level may lead to better prognosis.

【Key words】NLRP3;neoplasm metastasis;nasopharyngeal carcinoma;LRSF/DSF

汪亦品，女，實(shí)驗(yàn)師，(電子信箱)yipin698@163.com，通信作者.