王芳 高英 李衛(wèi)民* 陳珺

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 3. 廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006

糖尿病(DM)是一種有多種并發(fā)癥的代謝性疾病，糖尿病性骨病是其中的一種。早在1927年Morrison等就認(rèn)識到病程較長的糖尿病患兒會出現(xiàn)骨生長發(fā)育遲緩和骨萎縮，到30-50年代，ALbright 等證實(shí)糖尿病自身可導(dǎo)致骨量丟失，糖尿病與骨質(zhì)疏松可同時存在。糖尿病(diabetes mellitus, DM)引起的骨質(zhì)疏松發(fā)病率為20%～60%[1,2]，骨折發(fā)病率為2%～12%[3]，對患者后期生活質(zhì)量造成極大影響。

黃芪散是治療消渴病的古方，源自北宋《圣濟(jì)總錄》，全方由葛根、黃芪、桑白皮3味藥按質(zhì)量比2∶1∶1的比例組成，原文記載“治三消渴疾”，益氣健脾，生津止渴，三消共治。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)黃芪散可顯著降低2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的FBG，提高OGTT，增加胰島素敏感指數(shù)(ISI)，同時改善糖尿病模型大鼠的糖脂代謝[4-6]。本研究通過建立糖尿病長期造模動物模型，觀察黃芪散在治療糖尿病的同時對骨骼的影響，為黃芪散防治糖尿病性骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量 180～200 g，2014年4月10日購進(jìn)時為7周齡，共30只。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，質(zhì)量合格證編號SCXK(粵)2013-0020。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室，喂飼全價顆粒飼料。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h明暗循環(huán)，溫度21～23℃，濕度50%～80%。本實(shí)驗(yàn)參照《廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，得到廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 高脂飼料配方

蔗糖20%，膽固醇1.2%，豬油20%，酪蛋白10%，磷酸氫鈣0.6%，石粉0.4%，基礎(chǔ)飼料47.8%。動物許可證號SXCK(粵)2013-0002。飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 主要儀器及試劑

T1000-電子天平(常州市雙杰測試儀器廠)；JB-2-恒溫磁力攪拌器(西北醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)；YM-III-石膏打磨機(jī)(上海雷磁儀器廠新涇分廠)；碳化鎢鋼刀(Leica Co.Germany)；DHG-9145A-電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；Bioquant-Osteo骨形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(BIOQUANT USA)；S1083-生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(Lloyd Instruments公司)；BSA223S-電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；電子游標(biāo)卡尺0-150 mm(上海恒量量具有限公司)。

Orange G(SIGMA，批號1001508585)，Hematoxylin(SIGMA批號101379249)，Acid Fuchsin(SIGMA，批號1001400602)，Light Green SF Yellowish(SIGMA，批號1001790137)，Ponceaus(SIGMA，批號101114261)，其它試劑均為分析純。

1.4 藥物制備

黃芪、葛根、桑白皮藥材，均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房有限公司。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥中心高英教授鑒定：黃芪為豆科植物膜莢黃芪A. membranaceus(Fisch.)Bunge 的干燥根；葛根為豆科植物野葛 Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 的干燥根；桑白皮為桑科植物桑 Moru salba L. 除去栓皮的干燥根皮。其提取方法見文獻(xiàn)[7]。

2 方法

2.1 T2DM模型大鼠的制備，動物分組及給藥

SD大鼠，適應(yīng)1周后，禁食12 h，乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血，測定Glu、TC、TG，作為基礎(chǔ)血糖血脂水平。取血3 d后，分2天，分兩批，禁食12 h，稱重，按35 mg·kg-1的劑量腹腔注射STZ，正常組注射等劑量緩沖鹽溶液造模。注射STZ 3周后，禁食12 h，乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血，測血糖血脂，根據(jù)體重，血糖血脂等指標(biāo)隨機(jī)均勻分3組，正常對照組A、模型組B、黃芪散給藥組H(動物給藥分組高中低劑量前期基礎(chǔ)已考察，見文獻(xiàn)4，故選擇最佳的原方配比組，黃芪散給藥劑量為10 ml·kg-1，精密稱取2.96 g混懸于10 ml 0.5%的阿拉伯樹膠中；以成人臨床劑量折算)。所有動物分組前每天用普通飼料喂食。分組后開始灌胃給藥。正常組給予基礎(chǔ)飼料，給藥組給予高脂飼料。以空腹血糖>7.8 mmol·L-1為造模成功。造模持續(xù)120 d。

2.2 樣本取材方法

每只大鼠于處死前第14、13 d皮下注射鈣黃綠素(Calcein) 5 mg·kg-1，作為第一次熒光標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第4、3 d皮下注射calcein(5 mg·kg-1)作為第二次熒光標(biāo)記，以在骨表面形成綠色雙熒光標(biāo)志，反映骨骼動態(tài)變化情況。兩次熒光標(biāo)記間隔時間一般為10 d。(處死當(dāng)天為0天倒推)。大鼠處死當(dāng)天分離出左側(cè)脛骨上段松質(zhì)骨(proximal tibia, PTM)，備做不脫鈣骨切片(硬包埋)，進(jìn)行骨形態(tài)計量學(xué)分析。分離左側(cè)股骨，剔除附著之肌肉、筋膜(保留骨膜)，生理鹽水沖洗，以生理鹽水浸潤的醫(yī)用紗布包裹，錫紙包于其外，做好組別標(biāo)記，-20℃冰箱凍存，待做骨生物力學(xué)。

2.3 骨組織計量學(xué)的測定

取左側(cè)脛骨近端1/3，將暴露切面的PTM立即投入4%多聚甲醛中固定24至48 h。依次用70%、95%乙醇脫水，各2 d；100%酒精脫水兩次，各1 d；二甲苯透明1 d。先后用浸液Ⅰ、浸液Ⅱ、浸液Ⅲ分別浸透骨標(biāo)本，各2 d。三種浸液的配置方法：浸液Ⅰ甲基丙烯酸甲酯90 ml，鄰苯二甲酸二丁酯30 ml，磁力攪拌器上攪拌3h。浸液Ⅱ 甲基丙烯酸甲酯90 ml，鄰苯二甲酸二丁酯30 ml，過氧化苯甲酰1.0 g，磁力攪拌器上攪拌4 h。浸液Ⅲ 甲基丙烯酸甲酯90 ml，鄰苯二甲酸二丁酯30 ml，過氧化苯甲酰2.5 g，磁力攪拌器上攪拌6 h。包埋后切5 μm的薄片行Masson-Goldner Trichrome 染色，封片后在骨形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行測定。

2.4 骨生物力學(xué)的測定

行股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)：取右側(cè)股骨，去除肌肉、韌帶，生理鹽水包裹于-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時以37℃生理鹽水解凍，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1表示，檢測器激活為10 N，跨距20 mm，加載速度為10 mm·min-1。參照文獻(xiàn)[8]，測定的指標(biāo)有結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)和材料力學(xué)指標(biāo)，結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)包括最大荷載、最大撓度、彈性荷載、彈性撓度和能量吸收。前四項(xiàng)指標(biāo)可以從儀器記錄值算出載荷-變形曲線讀出，能量吸收可用曲線下面積求得。測試材料力學(xué)指標(biāo)是通過繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線得到，包括彈性模量，最大應(yīng)力等。計算公式如表1。

表2 黃芪散對糖尿病大鼠血糖血脂影響結(jié)果Table 2 Effects of HQS on diabetic rats blood glucose and blood lipid

與正常組比較1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較3)P<0.05，4)P<0.01(表3-5相同)

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 黃芪散對血糖血脂的影響

如表2，與正常組相比，模型組FPG、TC、TG均顯著升高(P<0.01)，表明T2DM大鼠造模成功。與模型組相比，黃芪散均能顯著降低模型大鼠FPG、TC、TG(P<0.01，P<0.05)，說明黃芪散調(diào)節(jié)模型大鼠的糖脂代謝，且藥效穩(wěn)定。

3.2 黃芪散對糖尿病大鼠股骨的影響

如表3，與正常對照組比較，模型組在最大載荷(P<0.01)、斷裂載荷(P<0.01)、骨結(jié)構(gòu)硬度(P<0.05)、骨結(jié)構(gòu)韌性(P<0.01)、彈性模量(P<0.01)、最大撓度(P<0.01)上都有顯著差異。提示糖尿病可以引起骨質(zhì)受損。黃芪散給藥后的大鼠除對以上指標(biāo)有顯著影響外，還對最大能量吸收和斷裂撓度兩個指標(biāo)有顯著影響(P<0.01)。

圖1 大鼠股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of three-point bending test method

表1 三點(diǎn)彎曲法中生物力學(xué)性能參數(shù)的計算公式Table 1 Computational formula of three point bending methord

3.3 黃芪散對糖尿病大鼠脛骨的影響

正常組、模型組及給藥組大鼠脛骨上段骨組織形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(%Tb.Ar)、骨小梁寬度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)的變化情況如圖2、3和表4所示。脛骨上段動態(tài)參數(shù)標(biāo)記周長百分?jǐn)?shù)L.Pm(%)，骨礦化沉積率MAR(μm/d)，骨表面新骨形成率BFR/BS(%/year)，骨轉(zhuǎn)換率BFR/BV (%/year)，新骨年形成率BFR/TV (%/year)的變化情況如圖4和表5所示。

同正常組相比，模型組的骨小梁面積百分?jǐn)?shù)及骨小梁數(shù)目顯著降低了43.2%(P<0.01)，而骨小梁分離度顯著增加了120%(P<0.01)，骨小梁寬度減少了15.6%，表明2型糖尿病導(dǎo)致大鼠脛骨上段松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，呈現(xiàn)出骨質(zhì)疏松的狀態(tài)。給藥組與模型組相比，骨小梁面積百分?jǐn)?shù)增加了51.3%(P<0.01)、骨小梁寬度增加了23.1%、骨小梁數(shù)目增加了16.4%(P<0.01)，骨小梁分離度降低了48.7%。與模型組相比，給藥組動態(tài)參數(shù)上標(biāo)記周長百分?jǐn)?shù)L.Pm(%)增長113.8%(P<0.05)了，骨礦化沉積率增加了13.5%(P<0.01)，骨表面新骨形成率BFR/BS增加了113.4%(%/year)(P<0.05)，骨轉(zhuǎn)換率BFR/BV (%/year)增加了62.5%(P<0.05)，新骨年形成率BFR/TV(%/year)略有上升。

表3 大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果Table 3 Effect of HQS on biomechanical properties of femora in rats

圖2 大鼠脛骨上段5 μm切片Masson-Goldner Trichrome 染色(放大倍數(shù)為10×2)Fig.2 5 μm section of proximal tibial in rats with dyeing(magnification times 10×2)

圖3 大鼠脛骨上段5 μm切片HE染色(放大倍數(shù)為10×2)Fig.3 5 μm section of proximal tibial in rats with dyeing(magnification times10×2)

圖4 大鼠脛骨上段45 μm切片熒光標(biāo)記(放大倍數(shù)為10)Fig.4 Fluorescent of 45μm section of proximal tibial in rats (magnification times10)

表4 黃芪散對糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠脛骨上段松質(zhì)骨(PTM)靜態(tài)參數(shù)結(jié)果Table 4 Eeffct of HQS on static histomoprhometric parameters of PTM in diabetic osteoporosis n=8)

表5 黃芪散對糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠脛骨上段松質(zhì)骨(PTM)動態(tài)參數(shù)結(jié)果Table 5 Eeffct of HQS on dynamic histomoprhometric parameters of PTM in diabetic osteoporosis rats n=8)

4 討論

糖尿病性骨質(zhì)疏松(Diabetic osteoporosis,DOP)是在血糖控制較差狀況下引起的主要骨代謝疾病，表現(xiàn)為骨量減少，骨折發(fā)生率上升。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠處死后取動物骨骼肌時，給藥組動物骨骼不易折斷，模型組動物骨骼易折斷，因此開展黃芪散對糖尿病骨的影響研究。

骨組織生物力學(xué)測定不是直接對骨的結(jié)構(gòu)和骨的總量的測定，而是針對由于骨結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致骨的強(qiáng)度的改變。骨標(biāo)本的力學(xué)測試可以反映標(biāo)本的結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)的性質(zhì)參數(shù)，骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)指整個結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能，不但與骨的材料特性有關(guān)，也受骨的幾何特性，即形狀、尺寸等影響。載荷-變形曲線是描述骨結(jié)構(gòu)力學(xué)特性中載荷與變形關(guān)系的一種曲線，反映骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性。結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)包括最大荷載、最大撓度和能量吸收。測試材料力學(xué)指標(biāo)是通過繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線得到，包括彈性模量等。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病長期狀態(tài)下對骨骼的強(qiáng)度會產(chǎn)生影響，黃芪散給藥后的大鼠在骨試件所承受的外力、骨材料韌性、骨內(nèi)在硬度(不受幾何因素影響)、骨脆性上都有所改善。

骨組織形態(tài)計量學(xué)是將揭示骨生理病理的機(jī)能改變與組織定量學(xué)研究有機(jī)結(jié)合，是評價骨轉(zhuǎn)換與骨結(jié)構(gòu)的有效手段，與BMD測量相比，其指標(biāo)敏感性更高，能直觀、形象地對皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨進(jìn)行定量分析。其通過對骨重建和骨量、骨結(jié)構(gòu)變化的探討，在評價藥物作用環(huán)節(jié)——抑制骨吸收或(和)促進(jìn)骨形成功能中具有重要意義。美國 FDA要求對具有全新結(jié)構(gòu)的抗骨質(zhì)疏松藥物的藥效學(xué)研究中，必須提供骨形態(tài)計量學(xué)研究參數(shù)的資料[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2型糖尿病可導(dǎo)致大鼠脛骨上段松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，骨小梁數(shù)目明顯減少，骨質(zhì)松脆、斷裂，骨髓腔擴(kuò)大。靜態(tài)參數(shù)反映HQS可提高糖尿病大鼠的骨量，與模型組有顯著差異，但與正常組也有一定差距。這點(diǎn)也許和用藥劑量，用藥時間有關(guān)。動態(tài)參數(shù)反映HQS可提高成骨細(xì)胞活性(P<0.05)。骨表面形成表現(xiàn)活躍(P<0.05)，骨轉(zhuǎn)換也較高。實(shí)驗(yàn)中我們也對脛骨的皮質(zhì)骨進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測定，但未發(fā)現(xiàn)顯著影響。糖尿病長期造模組也未對皮質(zhì)骨有顯著影響。

涉及防治糖尿病性骨質(zhì)疏松的中藥有很多報道，黃芪散方中主要成分黃芪多糖、黃芪總皂苷與黃芪甲苷、葛根素及桑糖苷元A均有降糖，改善胰島素抵抗作用[10]。其中黃芪甲苷可誘導(dǎo)成骨活性[11]。葛根素在膠原蛋白基質(zhì)中有效局部增加新骨生成，可用于骨移植或骨誘導(dǎo)的手術(shù)治療。葛根素還可通過抑制骨吸收，刺激骨形成來調(diào)控骨代謝[12]。黃芪散水提液及其黃酮類提取物對Ⅱ型糖尿病動物模型表現(xiàn)出較好的治療作用，可顯著降低T2DM小鼠和大鼠的血糖及高胰島素水平，增加糖耐量。同時明顯改善脂質(zhì)代謝，減輕模型組大鼠的體重。顯著下調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、瘦素的水平。因此本課題后期還需進(jìn)一步對方中成分及對成骨細(xì)胞相關(guān)功能開展研究。