黃志榮 朱麗斌 吳海游 陳麗思 呂思敏 許碧蓮 崔燎 鄒麗宜* 吳鐵,,*

1. 廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 東莞 5238082 2. 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湛江 5240233 3. 廣東醫(yī)學(xué)院廣東潤(rùn)和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心， 東莞 523808

輔酶Q10(coenzymeQ10, Co Q10)屬于脂溶性醌類化合物，廣泛存在于所有的生物膜中，參與到呼吸鏈電子傳遞、抗氧化、代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化調(diào)節(jié)等過(guò)程中，同時(shí)輔酶Q10是一種具有強(qiáng)大的清除自由基作用的抗氧化劑[1]。本課題組之前已經(jīng)[2]在30 mg·kg-1·d-1這一個(gè)劑量探究過(guò)Co Q10對(duì)環(huán)磷酰胺模型的大鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)骨量有一定的改善作用。維生素E(vitamin E, VE)是高效的抗氧化劑和自由基清除劑，維生素E與Co Q10都是抗氧化劑，本課題組[3]已經(jīng)證明250mg/kg這一個(gè)劑量能有效預(yù)防衰老小鼠的骨丟失，因此以VE作為陽(yáng)性對(duì)照藥。這次我們采用不同大劑量的Co Q10，同時(shí)以8月齡的小鼠作為研究對(duì)象，探究不同大劑量Co Q10對(duì)小鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)的影響，并與維生素E(vitamin E, VE)聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行對(duì)比，為Co Q10抗骨質(zhì)疏松的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

35只SPF級(jí)8月齡雌性KM小鼠，由南方醫(yī)學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重(45.51±4.67)g，動(dòng)物合格證：SCXK(粵)2011-0015。

1.2藥品與試劑

輔酶Q10(藥用原料藥)：由廣東潤(rùn)和生物科技有限公司提供，少量的大豆卵磷脂(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：714B023)作為表面活性劑，先讓其溶解在黑芝麻油(平輿康博匯鑫油脂有限公司)中，之后將2 500 mg和5 000 mg的輔酶Q10分別添加到50ml卵磷脂黑芝麻油中攪拌溶解即可得；維生素E軟膠囊(廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，批號(hào)：LE40017)；生理鹽水(東莞市普濟(jì)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：14082501);Micro CT儀(viva CT40; SCANCO Medical AG);Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)(MTS; USA)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8月齡KM小鼠35只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，按體重對(duì)等原則隨機(jī)分為5組，每組7只。A組為正常對(duì)照(CON)組，該組小鼠每天灌胃給予生理鹽水10 ml/(kg·d);B組為維生素E(VE)組，該組小鼠每天灌胃給予VE250 mg/(kg·d)；C組輔酶Q10(Co Q10L)低劑量組，該組小鼠每天灌胃給予Co Q10500 mg/(kg· d)；D組輔酶Q10(Co Q10H)高劑量組，該組小鼠每天灌胃給予Co Q101 000 mg/(kg·d)。E組輔酶Q10(Co Q10L)低劑量聯(lián)合維生素E(VE)組，該組小鼠每天灌胃給予Co Q10500 mg/(kg·d)和VE250 mg/(kg·d)。5組動(dòng)物均自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)共給藥10周，每隔1周稱取體重1次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取右側(cè)股骨進(jìn)行Micro-CT掃描和三維重建，取左側(cè)股骨進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)。

1.4骨生物力學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)時(shí)，將-20℃保存的股骨常溫解凍，生理鹽水復(fù)濕。用858 Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)監(jiān)測(cè)和分析小鼠左側(cè)股骨的生物力學(xué)性能。將股骨置于流變儀上分別進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，加載速度為0.155mm/s，跨距 9mm。由載荷、橈度換算并繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線，從曲線上讀取及根據(jù)公式計(jì)算相應(yīng)的指標(biāo)：最大載荷(Maximum load)、最大位移(Maximum displacement)、彈性載荷(Elastic load)、彈性位移(Elastic displacement)、剛度(Stiffness)等。

1.5Micro-CT測(cè)量

將處理好的小鼠股骨放入Micro-CT儀，對(duì)股骨的近干骺段進(jìn)行X射線掃描。掃描條件為：圖像矩陣為2048×2048,整合時(shí)間為200 ms，能量/強(qiáng)度為70 kVp、114 μA、8 W。以0°旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描完成后，選取生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)進(jìn)行三維重組，最低閾值為160提取圖像信息。獲取重組圖像后，使用Micro-CT自帶的軟件進(jìn)行定量分析。物理參數(shù)分析如下：骨密度(bone mineral density, BMD)、連接密度(connection density, Conn.D)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/total volume, BV/TV)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index, SMI)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)。

1.6數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1各組小鼠實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后的體重變化

如表所示，與CON組相比， Co Q10L、Co Q10H、VE組小鼠和Co Q10L聯(lián)合VE組的體重差異無(wú)顯著意義(P>0.05)，提示Co Q10和VE對(duì)小鼠的體重影響不大。

表1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后的體重變化Table 1 Changes of body weight in mice of different groups n=7)

注：CON為正常組、VE為維生素E組、Co Q10L為輔酶Q10低劑量組、Co Q10H為輔酶Q10高劑量組、Co Q10L+VE為輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E組。

2.2各組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的變化與CON組比較，Co Q10L組BV/TV明顯上升112.4%(P<0.05),連接密度明顯上升175.8%(P<0.01),骨密度BMD明顯上升112.45%(P<0.01),SMI明顯下降34.21%(P<0.01),但是Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒(méi)有明顯變化。與CON組比較，Co Q10H組BV/TV上升75%,連接密度明顯上升200.3%(P<0.01),骨密度BMD上升76.9%(P>0.05),SMI明顯下降30.52%(P<0.05),同時(shí)Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒(méi)有明顯變化。

與CON組比較，VE組BV/TV沒(méi)有明顯的變化,連接密度明顯上升158.8%(P<0.01),骨密度BMD明顯上升82.8%(P<0.01),SMI明顯下降36.84%(P<0.01)但是Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒(méi)有明顯變化。Co Q10L組、Co Q10H組與分別與VE組比較，兩組間的參數(shù)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

與CON組比較，Co Q10L聯(lián)合VE組BV/TV上升了54.9%(P>0.05),連接密度明顯上升162.7%(P<0.01),骨密度BMD上升54.9%(P>0.05),但是SMI,Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th沒(méi)有明顯變化。Co Q10L+VE組分別與VE組、Co Q10L組、Co Q10H比較，兩組間的參數(shù)均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表 2。

表2 Micro CT測(cè)定的小鼠股骨骨密度，骨體積分?jǐn)?shù)，連接密度，數(shù)量，分離度和厚度參數(shù)Table 2 Changes of microstructural parameters of distal femur in mice of different

*P<0.05,**P<0.01,vs CON 注：CON為正常組、VE為維生素E組、Co Q10L為輔酶Q10低劑量組、Co Q10H為輔酶Q10高劑量組、Co Q10L+VE為輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E組。

2.3各組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨Micro-CT二維圖和三維圖

與CON組(圖1-A)比較，Co Q10L(圖1-C)骨小梁走向一致，結(jié)構(gòu)緊密，區(qū)域出現(xiàn)更為明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，保持完整的微觀構(gòu)筑。同時(shí)Co Q10低劑量與VE組(圖1-B)較CON組要完整，主要表現(xiàn)為骨小梁增多，間隙變小，排列有序出現(xiàn)較多完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)。Co Q10高劑量組(圖1-D)出現(xiàn)部分的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是較Co Q10低劑量組(圖1-C)要稀疏。Co Q10L+VE(圖1-E)組骨小梁數(shù)目稀疏，間隙變大。見圖1。

2.4各組小鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)變化

與CON組比較，Co Q10L組的剛度明顯上升21.86%(P<0.05), 最大載荷上升27.23%(P>0.05)，說(shuō)明Co Q10L組股骨韌性增加，脆性減弱，抗變形能力有所增強(qiáng)。與CON組比較，Co Q10H組的最大位移明顯上升46.67%(P<0.05)，但是彈性載荷明顯下降18.32%(P<0.05)。

圖1 各組小鼠遠(yuǎn)端股骨的顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Micrographs of the vertical section of distal femur in different groups of miceNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

圖2 各組小鼠遠(yuǎn)端股骨的SEG三維重建圖注：圖2為SEG圖，反映骨小梁的數(shù)量Fig.2 Segmented(SEG) image ofmicro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

圖3 各組小鼠遠(yuǎn)端股骨的分離度的三維重建圖注：圖3為SP圖，反映骨小梁的分離度情況，從綠到紅，反映了骨分離度從小到大Fig.3 Trabecular separation image ofmicro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

圖4 各組小鼠遠(yuǎn)端股骨的厚度的三維重建圖注：圖4為TH圖，反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚。Fig.4 Trabecular thickness image of micro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

與CON組比較，VE組最大載荷、最大位移、彈性載荷、剛度有所上升，但變化沒(méi)有顯著性差別。Co Q10L組與VE組之間變化沒(méi)有差別。與CON組比較，Co Q10L聯(lián)合VE組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

3 討論

骨生物力學(xué)主要是研究骨組織在外界作用下的力學(xué)性能和骨在受力后的所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，是評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨質(zhì)量的指標(biāo)，骨量的減少以及骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變均能影響骨生物力學(xué)，可降低生物力學(xué)強(qiáng)度[4]。另外，Micro-CT通過(guò)X線掃描和三維重建，極大地解決了骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量方面存在切片方向的不固定性和二維平面的局限性的問(wèn)題，成為研究分析骨微觀結(jié)構(gòu)的新興技術(shù)，是理想的研究骨形態(tài)學(xué)的工具[5]。從小鼠股骨二維縱切面截圖和三維結(jié)構(gòu)重建后的分割圖直接觀察骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)，縱切面截圖能夠直觀表現(xiàn)骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)，骨小梁分離度圖可反映骨小梁的距離情況，從綠到紅，反映了骨小梁之間的距離越來(lái)越大。骨小梁厚度圖除了可見骨小梁的結(jié)構(gòu)和幾何信息外，還可接反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚，給骨骼的結(jié)構(gòu)參數(shù)及力學(xué)參數(shù)的定量數(shù)值，觀察骨微結(jié)構(gòu)變化[6]。

表3 各組小鼠股骨的最大載荷，最大位移，彈性載荷，彈性位移，剛度Table 3 Changes of biomechanical peoperties of femur in mice of different

*P<0.05 vs CON 注：CON為正常組、VE為維生素E組、Co Q10L為輔酶Q10低劑量組、Co Q10H為輔酶Q10高劑量組、Co Q10L+VE為輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E組。

3.1輔酶Q10對(duì)10月齡小鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)的影響

由表2和表3結(jié)果可知，Co Q10對(duì)10月齡小鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)有一定的改善作用。與CON組相比，Co Q10L組的剛度明顯增加，剛度反映抗變形能力，說(shuō)明Co Q10L能增加小鼠股骨抗變形能力。另外，Co Q10L組SMI明顯下降，BV/TV、BMD和Conn.D明顯升高。SMI 是用于評(píng)價(jià)骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)，定義骨小梁板狀和桿狀的程度，理想板狀結(jié)構(gòu)為0，理想桿狀結(jié)構(gòu)為3，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，SMI數(shù)值增加，說(shuō)明Co Q10L組骨小梁結(jié)構(gòu)有所改善。Co Q10L組能明顯增加BV/TV，BV/TV是描述松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的一個(gè)參數(shù)，能夠反映松質(zhì)骨樣本內(nèi)骨組織體積的含量，提示Co Q10L能提高小鼠股骨的骨體積分?jǐn)?shù)。Co Q10L組BMD和Conn.D明顯升高，BMD和Conn.D分別描述骨密度和連接密度，說(shuō)明Co Q10L能明顯增加小鼠股骨骨密度，并使其結(jié)構(gòu)相對(duì)緊密。Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分別描述厚度、骨小梁數(shù)目和分離度這三方面，雖然Co Q10L組這三個(gè)參數(shù)沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是Tb.Th、Tb.N有所上升和Tb.Sp有所下降。Co Q10L組BV/TV、BMD和Conn.D明顯升高說(shuō)明輔酶Q10可能通過(guò)調(diào)節(jié)核因子-κB(RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程，從而抑制破骨細(xì)胞的活性[7]，破骨細(xì)胞吸收能力小于成骨細(xì)胞骨形成功能，使得吸收范圍減少，進(jìn)而使其連接密度、骨小梁數(shù)目和骨體積增多，小鼠股骨松質(zhì)骨網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性得以保存，這與生物力學(xué)的參數(shù)結(jié)果相符合，表明松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)的改變影響了骨承載能力，對(duì)生物力學(xué)性能產(chǎn)生影響。

與CON組相比，Co Q10H組彈性載荷和最大位移明顯增加，提示Co Q10H能夠改善小鼠股骨的韌性。另外，Co Q10H組BV/TV、SMI和Conn.D明顯上升，但是在Tb.Th和Tb.N并沒(méi)有改變，說(shuō)明骨體積、骨結(jié)構(gòu)和連接密度雖然有明顯的提高，但是骨小梁數(shù)目和骨的厚度并沒(méi)有提高，從而只是使股骨結(jié)構(gòu)的韌性得到提高，提示了使用過(guò)高劑量的輔酶 Q10并不能改善小鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)，因?yàn)镃o Q10在破骨細(xì)胞的生成的過(guò)程中會(huì)抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、NFATc1的基因表達(dá)以及相關(guān)免疫球蛋白樣受體而使破細(xì)胞活性減低，但是其作用有與Co Q10的劑量呈一定的劑量相關(guān)性，在一定的濃度范圍內(nèi)才會(huì)使破骨細(xì)胞活性減低[7]。這提示了過(guò)大劑量的Co Q10并不能改善小鼠的骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能，要在合適的劑量范圍內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生作用，這也說(shuō)明了之前我們課題組30 mg·kg-1·d-1Co Q10這一劑量太小，導(dǎo)致環(huán)磷酰胺模型的大鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)和骨量只有一定的改善作用，并沒(méi)有很好的提高其骨密度和生物力學(xué)性能。

3.2維生素E對(duì)10月齡小鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)的影響

維生素E是高效的抗氧化劑和自由基清除劑，它主要通過(guò)抗氧化清除自由基，減少成骨細(xì)胞的氧化傾向同時(shí)刺激成骨細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)骨健康[8-9]。由表2中可得，與CON組比較，VE組小鼠股骨的部分參數(shù)有所修復(fù)，BMD和Conn.D明顯增加，BV/TV有上升的趨勢(shì)，Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示維生素E可能在Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp三個(gè)方面的共同作用下使BMD增加。

3.3輔酶Q10低劑量聯(lián)合維生素E對(duì)10月齡小鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)的影響

與CON組比較，由表2和表3結(jié)果可知，Co Q10L聯(lián)合VE組只有Conn.D明顯升高，其他參數(shù)并沒(méi)有太大的變化，生物力學(xué)方面參數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明Co Q10L聯(lián)合VE組對(duì)小鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)改善作用有限，這同時(shí)說(shuō)明了單一應(yīng)用Co Q10或者VE都能一定的改善小鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)參數(shù)，但是聯(lián)合應(yīng)用在一起卻沒(méi)有很好的效果，其中的原因可能是藥物的協(xié)同作用所致，有研究[10]指出在抗氧化的過(guò)程中Co Q10和VE有協(xié)同作用，Co Q10通過(guò)還原VE在清除自由基是產(chǎn)生的α-生育酚?；杂苫?，節(jié)約和再生VE，但是其中Co Q10和VE劑量大小的配伍，卻有待進(jìn)一步的探討，同時(shí)說(shuō)明了Co Q10L聯(lián)合VE組的劑量并不是合適的濃度。VE主要的機(jī)制是通過(guò)抗氧化清除自由基，減少成骨細(xì)胞的氧化傾向同時(shí)刺激成骨細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)骨健康。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，輔酶Q10減少活性自由基表達(dá)的同時(shí)，抑制破骨細(xì)胞的形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化[11]，這提示了輔酶Q10可參與調(diào)節(jié)骨代謝的過(guò)程，抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生。近幾年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道輔酶Q10有改善骨關(guān)節(jié)炎和骨退化的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮和炎癥細(xì)胞因子[12]，因此Co Q10主要通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的表達(dá)，兩者的作用機(jī)制不一樣，對(duì)骨的影響也是在不同的方面。

3.4小結(jié)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究了500 mg/(kg·d)Co Q10在預(yù)防小鼠骨質(zhì)疏松中的作用效果，已表現(xiàn)出了良好的效果，特別是其改善骨質(zhì)量，增加骨生物力學(xué)性能的作用。這一現(xiàn)象提示Co Q10在抗骨疏松方面具有良好的應(yīng)用前景，但是其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探究。