粟麟 李雙蕾 陳文輝 馬汝潔 莫文秋

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530001 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530001 3. 要江蘇連云港市贛榆區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，連云港 222100

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是因糖尿病(diabetes mellitus，DM)高血漿葡萄糖水平的內(nèi)環(huán)境下并發(fā)的骨吸收與骨形成失衡致使骨量減少、骨顯微結(jié)構(gòu)受損、骨強(qiáng)度降低，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。中醫(yī)認(rèn)為DOP屬于“骨痿”、“骨痹”等范疇，病位在腎，與肝、脾密切相關(guān)聯(lián)，性屬本虛標(biāo)實(shí)，其主證為腎虛脾虧、脈絡(luò)瘀阻。其治療規(guī)律不同于一般骨痿，應(yīng)以消渴為本，骨痿為標(biāo)。壯骨方以補(bǔ)腎壯骨、益氣健脾、活血通絡(luò)佐益氣養(yǎng)陰為法，在骨痿病性的基礎(chǔ)上兼顧消渴氣陰兩虛的特點(diǎn)。經(jīng)臨床觀察對(duì)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥具有較好的療效[2]，但對(duì)其療效的現(xiàn)代機(jī)制研究尚不足。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)是促細(xì)胞分化增殖作用以及刺激后成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)的因子，在促進(jìn)成骨細(xì)胞生成、分化、增強(qiáng)其活性方面具有重要作用[3-4]；腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor，TNF-α)作為重要的炎性因子，介導(dǎo)炎性過(guò)程導(dǎo)致骨量丟失，起著關(guān)鍵性作用而受到研究者們的關(guān)注[5]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從血清IGF-1、TNF-α表達(dá)水平等方面探討壯骨方防治DOP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，體重(161±6.56)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002，大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房，室溫25℃～28℃，通風(fēng)，自然采光，大鼠自由進(jìn)食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料均由廣西中醫(yī)藥研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器

酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)檢測(cè)試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司)；血糖儀(德國(guó)羅氏血糖儀公司)；Discovery-A型雙能X線吸收骨密度儀(美國(guó)HOLOGIC公司)；倒置顯微鏡、半自動(dòng)圖像數(shù)字化分析儀(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan)。

1.3 藥品

壯骨方(淫羊藿、枸杞、黃芪、骨碎補(bǔ)、杜仲、牛膝、山藥、白術(shù)、丹參、田七、甘草組成，采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的單味中藥濃縮顆粒劑)；鹽酸二甲雙胍片(江蘇蘇中海欣制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32021625；生產(chǎn)批號(hào)：12123012)；鏈脲佐菌素(美國(guó)sigma化學(xué)制劑公司)；水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物模型建立：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)將70只大鼠分為空白組(Blank 10只)、造模組(60只)。造模組給予高脂飼料，空白組給予普通飼料，喂養(yǎng)4周后，予以禁食12 h，造模組一次性腹腔注射2%STZ(35 mg/kg)，空白組腹腔等量注射0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液。72 h后斷尾取血測(cè)定空腹血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L視為2型糖尿病大鼠模型造模成功，共54只大鼠造模成功。

1.4.2動(dòng)物分組及給藥方法：隨機(jī)挑選50只2型糖尿病造模成功大鼠隨機(jī)分為5組：模型組(DM)、二甲雙胍組(DM+MET)、壯骨方低劑量組(DM+MET+ZGF-L)、壯骨方中劑量組(DM+MET+ZGF-M)、壯骨方高劑量組(DM+MET+ZGF-H)，各10只。DM+MET組用鹽酸二甲雙胍片以157.5 mg/kg用蒸餾水溶解灌胃。壯骨方3個(gè)劑量組在與DM + MET組使用同等劑量鹽酸二甲雙胍灌胃的基礎(chǔ)上分別以壯骨方高、中、低劑量灌胃，其中不同劑量組別分別含生藥3 g/ml、1.5 g/ml、0.75 g/ml。空白組及模型組等量蒸餾水灌胃。各組大鼠灌胃量均為1.5 ml/100 g，2次/天，灌胃后正常進(jìn)食，經(jīng)以上處理12周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1血清檢測(cè)：分別于給藥后第4、8、12周，麻醉下眶緣靜脈取血，室溫靜置后離心(3000 r/10 min)分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa法)測(cè)定血清IGF-1、TNF-α水平，按Elisa試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.2骨密度(BMD)測(cè)定：由廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨密度室專業(yè)人員操作完成，采用美國(guó)HOLOGIC公司Discovery-A型雙能X線吸收骨密度儀，掃描軟件為小動(dòng)物軟件(版本：3.9.4)，測(cè)量條件為：掃描速度60 mm/s，測(cè)定面積0.24 cm2。

1.5.3骨形態(tài)學(xué)及骨計(jì)量單位測(cè)定：給藥后第12周，麻醉下腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，冰上剝離動(dòng)物右側(cè)后肢脛骨，剔除所有筋膜、軟組織，用低速鋸取上段備用。置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，放入7%EDTA脫鈣2周，流水沖洗24 h，乙醇中逐級(jí)脫水，正丁醇過(guò)夜，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(5 μm)，使用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量以下參數(shù)：骨小梁面積(Trabecular Bone Area，Tb.Ar)；骨小梁周長(zhǎng)(Trabecular Surface，Tb.Pm)；骨小梁面積百分比(Percent Trabecular Area，%Tb.Ar)；骨小梁數(shù)量(Trabecular Number，Tb.N)；骨小梁分離度(Trabecular Separoation，Tb.Sp)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血糖

給藥后對(duì)各組的FBG水平監(jiān)測(cè)顯示(表1)，DM組血糖水平明顯高于其他各組，壯骨方治療組與二甲雙胍組均可降低血糖(P<0.01)。壯骨方治療組與二甲雙胍組相比在第4周、第8周血糖水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，但是第12周壯骨方高劑量組FBG水平低于同期單純二甲雙胍治療組(P<0.01)。

表1 壯骨方對(duì)2型糖尿病大鼠FBG水平的影響Table 1 Effect of ZGF on FBG in type

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

2.2.1給藥12周后骨密度結(jié)果：給藥12周后，給藥后對(duì)各組的骨密度檢測(cè)顯示(表2)，DM組骨密度值(0.1496±0.0061)g/cm2低于空白組(0.1796±0.0072) g/cm2，P<0.01；壯骨方治療組骨密度值均高于模型組(P<0.01)，且呈劑量依賴性，其中低劑量組骨密度值為(0.1628±0.0057) g/cm2，中劑量組骨密度值為(0.1665±0.0052)g/cm2，高劑量組骨密度值為(0.1745±0.0062)g/cm2；二甲雙胍組骨密度值(0.1590±0.0055) g/cm2高于模型組(P<0.05)。壯骨方高劑量組骨密度值高于單純二甲雙胍組(P<0.01)。

2.2.2給藥12周后骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)結(jié)果：給藥12周后，DM組Tb.Ar、Tb.Pm、%Tb.Ar、Tb.N明顯下降，Tb.Sp增加(P<0.01)，壯骨方3個(gè)劑量組與二甲雙胍組Tb.Ar、Tb.Pm、%Tb.Ar、Tb.N水平明顯增加(P<0.01)；其中壯骨方高劑量組、中劑量組Tb.Ar、%Tb.Ar水平較二甲雙胍組增加(P<0.05)；高劑量組Tb.Pm、Tb.N水平較二甲雙胍組增加(P<0.05)，骨小梁分離度各組之間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 給藥12周后各組骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)結(jié)果Table 2 The result of bone histomorphometry parameters in each group after the treatment for 12 weeks n=10)

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

2.3 血清IGF-1、TNF-α

第4、8、12周監(jiān)測(cè)各組大鼠血清IGF-1(表3)、TNF-α(表4)水平后顯示，治療組較DM組血清IGF-1水平增高、TNF-α水平降低(P<0.01)，但比較各治療組之間顯示：壯骨方高、中劑量治療組較二甲雙胍組血清IGF-1水平增高、TNF-α水平降低(P<0.01)，壯骨方低劑量組與二甲雙胍組之間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 壯骨方對(duì)2型糖尿病大鼠血清IGF-1的影響Table 3 Effect of ZGF on serum IGF-1 in type 2 diabetic rats n=10)

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

表4 壯骨方對(duì)2型糖尿病大鼠血清TNF-α的影響Table 4 Effect of ZGF on serum TNF-α in type 2 diabetic rats n=10)

注：與空白組比較：○P<0.05，●P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與二甲雙胍組比較：☆P<0.05，★P<0.01

3 討論

DOP獨(dú)特病理內(nèi)環(huán)境增加了合并慢性炎癥的風(fēng)險(xiǎn)和(或)炎癥嚴(yán)重程度[6]，使骨礦物丟失增加[1]。Verhaeghe J等研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血清1,25(OH)2D3結(jié)合蛋白顯著下降，十二指腸鈣吸收障礙，脛骨骨小梁數(shù)量下降44%，成骨細(xì)胞及其前體減少10%[7]。通過(guò)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生2型糖尿病，通過(guò)雙能X線吸收骨密度儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組BMD較其他各組下降(P<0.05)，并對(duì)造模成功的DM大鼠脛骨組織切片通過(guò)半自動(dòng)圖像數(shù)字化分析儀觀測(cè)到DM組大鼠較空白組大鼠骨小梁數(shù)量下降33%，小梁面積和周長(zhǎng)減小(P<0.05)，確定2型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松形成。

壯骨方(淫羊藿、枸杞、黃芪、骨碎補(bǔ)、杜仲、牛膝、山藥、白術(shù)、丹參、田七、甘草等)中以淫羊藿溫補(bǔ)腎陽(yáng)，枸杞滋補(bǔ)腎陰，黃芪益氣健脾用為君藥，三藥組合，陰陽(yáng)雙補(bǔ)，使腎精充沛，脾氣健運(yùn)，補(bǔ)益先天，調(diào)補(bǔ)后天。針對(duì)消渴并骨痿脾腎虧虛的根本病機(jī)發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮能增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性與分化，另一方面調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸功能，提高體內(nèi)雌激素水平，降低甲狀腺激素水平，促進(jìn)腸鈣吸收和骨鈣沉積[8]。此外Yin等[9]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)苷具有降低核因子-κB及其受體激活劑(receptor activator of nuclear factor-κB-ligand，RANKL)表達(dá)抑制破骨細(xì)胞活性的作用。淫羊藿苷有通過(guò)增加TNF受體家族之一的骨保護(hù)素(OPG)mRNA的表達(dá)而使核因子-κB受體RANKL受到競(jìng)爭(zhēng)性抑制，進(jìn)一步阻礙破骨細(xì)胞分化和成熟，抑制骨吸收[10]。高血糖使炎性因子及RANKL表達(dá)增多，OPG表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)壯骨方高、中劑量組較二甲雙胍組血清TNF-α、FBG水平顯著下降，但低劑量組與之相比無(wú)明顯差異，由此推測(cè)壯骨方呈劑量依賴性通過(guò)降低血漿葡萄糖水平與其中所含淫羊藿苷使OPG表達(dá)增多競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TNF-α因子使血清TNF-α水平有關(guān)；骨碎補(bǔ)總黃酮及骨碎補(bǔ)苷增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)腸鈣吸收，抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，抑制骨破壞。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者即使骨量、骨密度正常或升高也因IGF-1水平下降而致使骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[11]，因此IGF-1成為評(píng)估骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)的因素之一[12]。IGF-1由肝細(xì)胞合成和釋放，與其受體IGF1R在調(diào)控蛋白的作用下分布于血清入循環(huán)和局部骨組織而發(fā)揮其活性，在骨結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中調(diào)控軟骨細(xì)胞的肥大促進(jìn)縱向骨生長(zhǎng)[13]，同時(shí)也直接或間接介導(dǎo)體循環(huán)中生長(zhǎng)激素而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和骨結(jié)構(gòu)的形成[14-15]。近年來(lái)研究者們通過(guò)直接補(bǔ)充人重組IGF-1或間接升高體內(nèi)IGF-1水平的方式達(dá)到控制骨重吸收，抑制骨量減少，增加骨強(qiáng)度降低骨折風(fēng)險(xiǎn)等目的[16-18]。筆者通過(guò)監(jiān)測(cè)給藥過(guò)程中各組血清IGF-1，發(fā)現(xiàn)壯骨方高、中劑量治療組IGF-1水平明顯高于二甲雙胍組，結(jié)合其骨計(jì)量參數(shù)結(jié)果，推斷壯骨方可能通過(guò)升高機(jī)體內(nèi)血清IGF-1水平而維持骨微結(jié)構(gòu)，且這種作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。

通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，得出壯骨方防治2型糖尿病骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制為通過(guò)降低血糖、升高血清IGF-1、降低血清TNF-α水平促進(jìn)骨形成抑制骨吸收。但是其作用表現(xiàn)出劑量依賴性，提示進(jìn)一步進(jìn)行藥物最大有效量及相關(guān)藥物毒理研究。隨著細(xì)胞分子研究的開(kāi)展，壯骨方對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的作用信號(hào)通路仍有待探明。