張玲，劉平懷，羅寧，陳晨，何沂飛，李昂（海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心，海南海口570228）

小球藻Chlorella sorokiniana C74營(yíng)養(yǎng)素分析

張玲，劉平懷*，羅寧，陳晨，何沂飛，李昂
（海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心，海南?？?70228）

測(cè)定小球藻Chlorellasorokiniana C74營(yíng)養(yǎng)成分，為其綜合利用提供依據(jù)。結(jié)果顯示，Chlorella sorokiniana C74含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，粗蛋白、多糖、油脂、灰分、粗纖維和色素分別占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%。脂肪酸分析顯示Chlorella sorokiniana C74中含有多種不飽和脂肪酸，其中亞油酸和亞麻酸含量分別為22.73% 和14.87%；氨基酸含量為17.50%，其中必需氨基酸為6.17%，通過(guò)必需氨基酸指數(shù)評(píng)價(jià)，說(shuō)明Chlorella sorokiniana C74是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源；維生素含量豐富，尤其是維生素B1、B3和B6；藻粉含有多種礦物質(zhì)元素，其中鉀、鎂、鈣、鐵和鋅5種元素含量較高，重金屬鉛、汞、砷和鎘含量均未超標(biāo)。

小球藻；營(yíng)養(yǎng)成分；分析

小球藻（Chlorella sorokiniana C74）為小球藻屬（Chlorella）的一種微藻，細(xì)胞呈球形，卵形或者橢圓形，是一種生長(zhǎng)在池塘、湖泊的淺水港灣中微型（3 μm～8 μm）單細(xì)胞綠藻。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)小球藻（Chlorella sorokiniana）的研究集中在培養(yǎng)條件優(yōu)化［1-2］、產(chǎn)油性能評(píng)價(jià)及污水廢氣處理等方面［3-5］，對(duì)其胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)研究較少。有研究顯示，不同營(yíng)養(yǎng)元素條件下，小球藻的營(yíng)養(yǎng)成分有顯著差異［6］。本研究對(duì)規(guī)?；囵B(yǎng)的小球藻C74進(jìn)行一般營(yíng)養(yǎng)成分、維生素、微量元素、氨基酸和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成分析，為此株小球藻的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1藻種

小球藻（Chlorella sorokiniana C74）：由海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2試劑

維生素A（分析純）：阿拉??；維生素E（GR）：上海安譜科學(xué)；維生素B1、B2、B3、B6（分析純）：都萊生物；維生素B12（GR）：阿拉?。豢箟难幔ǚ治黾儯?、5-磺基水楊酸（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.3儀器

CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)：日立；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)儀器；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：普析通用；AA-6800原子吸收分光光度計(jì)：島津；X Series-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾（Thermo Fisher）公司；TAS-990 Super AFG原子吸收光譜儀：普析通用。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1開(kāi)放式培養(yǎng)

向微藻培養(yǎng)管道加入適量的自來(lái)水（約700 L），加入微藻培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)元素，主要添加有尿素、甘氨酸、磷酸二氫銨、氯化鐵等，另適當(dāng)添加微量元素，打開(kāi)管道循環(huán)泵（可調(diào)速），約30 min后接入種子液（50 L～80 L）?？刂茰囟炔怀^(guò)40℃。培養(yǎng)周期約7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，6 000 r/min離心6 min，藻泥經(jīng)去離子水洗滌3次，真空冷凍干燥后保存于-20℃冰箱，備用。營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 營(yíng)養(yǎng)成分組成Table 1　The composition of nutrition

1.2.2常規(guī)成分測(cè)定

蛋白質(zhì)：雙縮脲法；總糖：蒽酮硫酸法；油脂：參照Luyen HQ［7］的方法測(cè)定；灰分：GB 5009.4-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》灼燒重量法；粗纖維：GB/T 5009.10-2003《植物類食品粗纖維測(cè)定法》；色素參照Wellburn AR［8］的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3脂肪酸分析

取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液5 mL，震蕩混合10 min，60℃水浴10 min，待溶液冷卻后加入1%硫酸-甲醇溶液8mL，震蕩混合10min，50℃水浴10 min，依次加入2 mL水和3 mL正己烷，分層后收集上層溶液（正己烷），重復(fù)萃取1次，合并正己烷溶液，待揮發(fā)濃縮至1 mL后，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，密封保存待檢測(cè)，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4氨基酸分析

1.2.4.1水解及檢測(cè)

稱取適量樣品于研缽中研磨破碎細(xì)胞壁，加入10%磺基水楊酸20 mL，混合均勻，于4℃下放置15 h～17 h，5 000 r/min離心6 min，濾液用4 mol/L NaOH調(diào)整pH至6.0，加入超純水定容至50 mL，取1 mL濾液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測(cè)濾液10 μL，進(jìn)行柱前衍生處理后采用Waters 2695液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

色氨酸參照GB/T 15400-1994《飼料中色氨酸測(cè)定方法分光光度法》來(lái)測(cè)定。

1.2.4.2必需氨基酸指數(shù)（EAAI）

根據(jù)蛋白質(zhì)飼料的評(píng)價(jià)方法——必需氨基酸指數(shù)（EAAI），評(píng)價(jià)氨基酸作為蛋白質(zhì)的可用性。EAAI計(jì)算公式［9］如下：

式中：aai為待測(cè)樣品中某必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)，%；AAi為參比蛋白質(zhì)中該必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)，%；n為必需氨基酸數(shù)。

1.2.5維生素含量測(cè)定

1.2.5.1樣品處理

水溶性維生素（維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素B6、維生素B12）：準(zhǔn)確稱取一定量的小球藻藻粉于研缽中研磨破碎細(xì)胞壁，用15 mL 0.1 mol/L的鹽酸浸泡，用超聲清洗器振蕩15 min，5 000 r/min下離心6min，上清液過(guò)濾，取濾液100 μL進(jìn)樣分析。

脂溶性維生素（維生素A、維生素E）：參照GB/T 5009.82-2003《食品中維生素A和維生素E的測(cè)定》處理樣品。

1.2.5.2檢測(cè)方法

1）維生素B1

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）= 97∶3；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速1.5 mL/min。

2）維生素B2

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）=9∶1，B為甲醇，A∶B=75∶25；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流速1.0 mL/min。

3）維生素B3

Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相0.05 mol/L KH2PO4-甲醇=9∶1；檢測(cè)波長(zhǎng)266nm；流速1.0 mL/min。

4）維生素B6

Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）=97∶3，B為甲醇，A∶B=9∶1；檢測(cè)波長(zhǎng)為226nm；流速1.2 mL/min。

5）維生素B12

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；其他色譜條件參照GB/T 5009.217-2008。

6）維生素A、維生素E

色譜柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈=1∶1；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm（維生素A），295 nm（維生素E）；流速1.0 mL/min。

7）維生素C

參照GB/T 5009.86-2003《蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測(cè)定熒光法和2，4-二硝基苯肼法》測(cè)定。1.2.6微量元素及重金屬測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.2g藻粉于聚四氟乙烯坩堝中，加入5mL HNO3和2 mL H2O2為消解酸體系，加蓋后于電熱板上100℃加熱。2 h后，開(kāi)蓋，將溫度升高至160℃繼續(xù)加熱，應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)坩堝。當(dāng)坩堝內(nèi)溶液呈澄清狀時(shí)，消解完成，取下待其冷卻，用超純水輕輕沖洗坩堝蓋和內(nèi)壁，定容至25 mL。

采用電感藕合等離子發(fā)射光譜-質(zhì)譜（ICP-MS）方法，對(duì)小球藻中Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Ga等28種微量元素進(jìn)行定量分析，采用原子吸收光譜儀對(duì)Na、K兩種常量元素進(jìn)行含量測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1常規(guī)成分

蛋白質(zhì)、多糖、油脂是生命的三大物質(zhì)基礎(chǔ)，是維持生命必不可少的營(yíng)養(yǎng)成分，膳食纖維是健康飲食不可缺少的，纖維在保持消化系統(tǒng)健康上扮演著重要的角色，同時(shí)攝取足夠的纖維也可以預(yù)防心血管疾病、癌癥、糖尿病以及其它疾病。

按照《中華人名共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》及相關(guān)文獻(xiàn)測(cè)定小球藻藻體內(nèi)的粗蛋白、碳水化合物、油脂、色素、灰分、粗纖維等成分。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2數(shù)據(jù)表明，小球藻中多糖含量最高（34.28%），其次為油脂，約占22%，有研究報(bào)道小球藻的油脂含量可達(dá)50%，說(shuō)明小球藻具有作為產(chǎn)油微藻的潛能［3］。粗蛋白和粗纖維的含量相近，約為20%，蛋白含量在小球藻中相對(duì)較低，這可能與培養(yǎng)條件相關(guān)；灰分含量約占藻體干重的12%，微藻中的灰分含量及組成與自然條件和成熟度等因素有關(guān)［10］。小球藻中色素含量約為4.5%左右，葉綠素和類胡蘿卜素是細(xì)胞中的重要色素，其中葉綠素a是人類和動(dòng)物血紅素的直接原料，被稱作是“綠色的血液”，類胡蘿卜素是一種高度不飽和化合物，具有抗氧化與增強(qiáng)免疫等功效。

2.2脂肪酸分析

脂質(zhì)的主要功能是組成生物膜、提供能量、作為脂溶性物質(zhì)的媒介。流行病學(xué)證明多食不飽和脂肪酸有利于身體健康，具有降血壓、降血脂以及抗動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)記憶力和思維能力等生理活性［11］。本研究采用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)小球藻脂肪酸成分進(jìn)行定量和定性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 小球藻主要營(yíng)養(yǎng)成分的含量Table 2　Contents of main nutritional component in Chlorella sorokiniana C74

表3　小球藻脂肪酸的組成Table 3　Fatty acids composition of Chlorella sorokiniana C74

從表3可見(jiàn)，測(cè)定出13種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的72%，而且鏈長(zhǎng)集中在C16～C18，其中順-9，12-十八碳二烯酸（亞油酸），順-9，12，15-十八碳三烯酸（亞麻酸）含量分別為22.73%和14.87%。亞油酸和亞麻酸是生命代謝的必需脂肪酸，是人體內(nèi)高度不飽和脂肪酸（EPA和DHA等）的合成前體。有資料顯示必需脂肪酸不僅能夠吸引水分滋潤(rùn)皮膚細(xì)胞，還能防止水分流失，具有改善高血壓、預(yù)防心肌梗死、預(yù)防膽固醇造成的膽結(jié)石和動(dòng)脈硬化的作用。本研究中小球藻富含亞油酸和亞麻酸，可作為人體多不飽和脂肪酸的來(lái)源。

2.3氨基酸

研究表示，缺乏氨基酸可以導(dǎo)致人體營(yíng)養(yǎng)不良，并出現(xiàn)多種不良反應(yīng)。特別是老年人在缺乏蛋白質(zhì)的情況下，極容易引起球蛋白和血漿蛋白的降低，導(dǎo)致老年人貧血。

氨基酸樣品經(jīng)高效液相共檢測(cè)到17種氨基酸，包含7種人體必需氨基酸。另外，色氨酸通過(guò)分光光度法測(cè)得。氨基酸測(cè)定結(jié)果兼表4。

從表4可知，小球藻氨基酸含量為17.50%，其中必需氨基酸為6.17%，為總氨基酸的35.26%。

將小球藻必需氨基酸與幾種常見(jiàn)食物必需氨基酸進(jìn)行比較［11］，見(jiàn)表5。

表4　小球藻氨基酸種類與含量Table 4　Contents of amino acid in Chlorella sorokiniana C74%

表5 小球藻及常見(jiàn)食物的必需氨基酸含量比較及EAAI值Table 5　The EAA comparation between Chlorella sorokiniana C74 and the common food and EAAI of microalgae with the common food as a reference

由表5可知，小球藻必需氨基酸高于玉米和小麥，低于大豆餅、亞麻仁餅、芝麻餅、魚(yú)粉、豬肉和對(duì)蝦。與常見(jiàn)食物相比，小球藻EAAI值均超過(guò)1，當(dāng)n=6＞12時(shí)，EAAI＞0.95為優(yōu)質(zhì)蛋白源，說(shuō)明小球藻是一種優(yōu)良的植物蛋白源。

2.4維生素

小球藻中維生素測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，小球藻與其它食物中維生素含量的比較如表7所示。

表6 小球藻維生素種類與含量Table 6　Contents of vitamin in Chlorella sorokiniana C74mg/100 g

表7　部分常見(jiàn)食物的維生素含量Table 7　Contents of vitamin in part of the common foodmg/100 g

表6顯示小球藻藻粉中含有多種維生素，其中水溶性維生素B1、維生素B3、維生素C以及脂溶性維生素E含量較高，分別為33.81、15.29、27.50、8.84 mg/100 g。表7列出了部分常見(jiàn)維生素食物的維生素含量［12］，通過(guò)比較表6和表7可知，小球藻中維生素B1及維生素B3的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)食物，維生素B1和維生素B3含量是分別是淀粉和瘦牛肉的3.75、2.43倍；維生素C的含量豐富，可與韭菜及橙相當(dāng)；藻粉中維生素A、維生素E的含量較高，分別是雞蛋黃的1.35倍和1.75倍；小球藻藻粉中維生素B6含量為2.52 mg/100 g，高于常見(jiàn)食品；維生素B12含量低于動(dòng)物類食品和黃豆，高于其他植物類食品，這是因?yàn)橹参镄允称分卸嗖缓S生素B12。Watanabe［13］研究發(fā)現(xiàn)可食性藻類富含維生素B12，如：紫菜含有具生物活性之維生素B12，含量為32 μg/100 g～78 μg/100 g干重。

維生素是維持身體健康所必需的一類有機(jī)化合物，有研究顯示，維生素B1具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用；還能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，增加食欲；維生素B2能夠促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞的再生，增進(jìn)視力；維生素B3促進(jìn)血液循環(huán)，使皮膚更健康，同時(shí)還能預(yù)防和緩解嚴(yán)重的偏頭痛；維生素C具有強(qiáng)的抗氧化能力，能抑制酪氨酸酶的形成，從而達(dá)到美白，淡斑的功效，是一種天然的抗氧化劑；維生素E能促進(jìn)生殖，抗自由基氧化、抑制血小板聚集等多種作用，還對(duì)燒傷、凍傷、毛細(xì)血管出血、更年期綜合癥、美容等方面有很好的療效。本研究中小球藻藻粉維生素種類齊全，含量豐富，且多種成分高于常規(guī)食物，是一種天然的優(yōu)質(zhì)的維生素來(lái)源，加工成食品或保健品對(duì)改善維生素缺乏的人群的身體健康狀況具有重要的意義。

2.5微量元素及礦物質(zhì)

小球藻中礦質(zhì)元素和重金屬種類及含量分別見(jiàn)表8和表9。

表8　小球藻礦物質(zhì)元素種類及含量Table 8　Contents of mineral element in Chlorella sorokiniana C74 mg/kg

表9　小球藻重金屬及含量Table 9　Contents of heavy metals in Chlorella sorokiniana C74

由表8、表9可知，小球藻含有豐富的礦物質(zhì)元素，其中以鉀、鎂、鈣、鐵和鋅5種元素含量最高，分別為12 305.67、2 064.28、879.0、280.92 mg/kg和78.36 mg/kg。重金屬鉛、汞、砷、鎘的含量均較低，且均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB2762-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》），證明此藻粉是安全無(wú)毒害的。小球藻包含有多種人體必需微量元素，如銅、鐵、鋅、硒、鉬、鉻、鈷及鎳等。盡管這些微量元素在人體內(nèi)含量極小，但它們對(duì)維持人體中的一些決定性的新陳代謝卻是十分必要的。鐵是構(gòu)成血紅蛋白的主要成分之一，缺鐵可引起缺鐵性貧血；缺硒會(huì)引起大骨節(jié)病發(fā)生，主要發(fā)生于青少年，嚴(yán)重地影響骨發(fā)育和日后勞動(dòng)生活能力。國(guó)外曾有報(bào)道，機(jī)體內(nèi)含鐵、銅、鋅總量減少會(huì)降低免疫能力，助長(zhǎng)細(xì)菌感染。小球藻富含多種礦物質(zhì)元素，由此可推斷小球藻具有作為人體必需微量元素的重要來(lái)源的潛能。

3　結(jié)論

小球藻細(xì)胞中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，粗蛋白質(zhì)、多糖、油脂、灰分、粗纖維和色素分別占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%。小球藻細(xì)胞成分的利用除了提取油脂外，還應(yīng)得到綜合利用。例如在提取油脂制備生物柴油后，用于蛋白和多糖的提取，蛋白質(zhì)可以作為人體或動(dòng)物食品的蛋白添加，而小球藻多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗病毒和抗輻射等多種生物學(xué)活性，可開(kāi)發(fā)成保健食品或醫(yī)藥原料。

小球藻除了含有大量的蛋白質(zhì)、多糖和油脂等營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有多種活性物質(zhì)，具有較高的綜合利用價(jià)值。脂肪酸分析顯示藻粉中含有多種不飽和脂肪酸，其中包含兩種人體必需氨基酸——亞油酸和亞麻酸，含量分別為22.73%和14.87%；氨基酸種類豐富，必需氨基酸含量較高，可以作為人體或動(dòng)物食品的蛋白來(lái)源；維生素含量豐富，尤其是維生素B1、B3和B6，可加工成食品或維生素保健品，改善因維生素缺乏而引起的不良反應(yīng)；藻粉含有多種生長(zhǎng)的必需常量和微量礦物質(zhì)元素，其中鉀、鎂、鈣、鐵和鋅5種元素含量較高，重金屬鉛、汞、砷和鎘含量未超標(biāo)，符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)。

總之，小球藻細(xì)胞含有多種值得利用的成分，對(duì)其利用應(yīng)不僅局限在制備生物柴油上，對(duì)其綜合利用也應(yīng)更加全面。

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Nutrient Analysis of Chlorella sorokiniana C74

ZHANG Ling，LIU Ping-huai*，LUO Ning，CHEN Chen，HE Yi-fei，LI Ang
（Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization/Ministry of Education Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Determination of Chlorella sorokiniana C74 nutrients，the results showed that Chlorella sorokiniana C74 contains kinds of nutrients，crude protein，carbohydrates，fat，ash，crude fiber and pigment was accounted for 20.4%，34.28%，22.16%，12.20%，20.22%and 4.50%by algae powder dry weight respectively. Fatty acid analysis showed that algae powder contains a variety of unsaturated fatty acids，and linoleic acid and linolenic acid contents were 22.73%and 14.87%.Contents of amino acid in Chlorella sorokiniana C74 was 17.50%，of which the essential amino acids was 6.17%.Through essential amino acid index evaluation，indicating that Chlorella sorokiniana C74 was an excellent source of protein；Chlorella sorokiniana C74 was rich in vitamins，especially vitamin B1，B3and B6.Algae powder contains a variety of trace mineral elements，and potassium，magnesium，calcium，iron and zinc was higher，the heavy metal lead，mercury，arsenic and cadmium was no more than the national standard.

Chlorella sorokiniana；nutritional components；analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.003

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題（2011BAD14B01）；海南省中藥現(xiàn)代化科技專項(xiàng)（ZY201327）；國(guó)家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（13C26244604892）；海南省產(chǎn)學(xué)研一體化項(xiàng)目（CXY20150034）

張玲（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微藻生物質(zhì)能源。
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劉平懷（1967—），男，教授，藥學(xué)研究員，主要從事微藻生物質(zhì)能源及天然產(chǎn)物的研究。

2015-04-07