劉連勇 陸志仁 游利 胡曉暉

1.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院內(nèi)分泌科，200125 2.江蘇省蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院，215123 3.上海市寶山區(qū)淞南社區(qū)服務(wù)中心，上海 200441 4.上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080 5.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院脊柱外科，200125

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是一種由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，從而使骨脆性增多的疾病。該病主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女，臨床上易于骨折，以及由骨折引起疼痛、骨骼變形等癥狀，嚴(yán)重地影響患者的身體健康和生活質(zhì)量，甚至縮短壽命。研究認(rèn)為，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松被認(rèn)為可能是一種炎癥過(guò)程，許多促進(jìn)炎癥和T細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子對(duì)骨量的丟失起到了重要作用[1]。然而目前，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過(guò)程中的機(jī)制尚未完全清楚。

CD4+T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的一種重要免疫細(xì)胞，在抗原與抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)存在時(shí)可以主要主要分化為T(mén)h1，Th2，Th17及Treg細(xì)胞[2-5]。其中，Th17細(xì)胞是一群通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子白介素-17(IL-17) 發(fā)揮多種生理病理學(xué)功能的細(xì)胞亞群[6]，目前的研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 中起作用，并與TNF-α 共同作用時(shí)增強(qiáng)了骨轉(zhuǎn)換和炎癥的發(fā)展的過(guò)程[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn) IL-17 是關(guān)節(jié)炎等其他影響骨量疾病的一個(gè)很重要的介導(dǎo)因素，并可以作治療上述疾病的重要的靶分子[8]。然而迄今，對(duì)于Th17細(xì)胞及相關(guān)因子在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松進(jìn)展中的具體作用及機(jī)制尚不完全明了。

因此，本研究通過(guò)對(duì)比絕經(jīng)后骨質(zhì)正常人群及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的外周血Th17細(xì)胞、分泌的細(xì)胞因子以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子水平，分析探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中Th17細(xì)胞與骨密度以及血清鈣可能存在的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年7月～2014年7月來(lái)我院治療的60例女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者為研究組，選取同期來(lái)我院體檢的60例女性絕經(jīng)后骨量正常人群為對(duì)照組。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組納入標(biāo)準(zhǔn)：①自然絕經(jīng)1年以上；②年齡50-65歲，平均61 .3 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①各種骨軟化癥、鈣與維生素D缺乏癥及腎小管酸中毒；②原發(fā)性、繼發(fā)性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)；③惡性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移；④多發(fā)性骨髓瘤；⑤脊髓血管瘤；⑥化膿性脊髓炎；⑦有明顯限制運(yùn)動(dòng)性疾病者，慢性?xún)?nèi)科疾病以及內(nèi)分泌疾病引起繼發(fā)性骨質(zhì)疏松者；⑧服用雌激素、肝素、皮質(zhì)類(lèi)固醇激素、二磷酸鹽等與骨質(zhì)疏松有關(guān)的藥物[9]。研究組和對(duì)照組的研究對(duì)象的性別、年齡等一般資料具有可比性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1兩組人群外周血Th17細(xì)胞流式染色：兩組人群均在早餐空腹采集外周血5 ml，加入EDTA抗凝劑，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，以完全1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)濃度至1×106細(xì)胞/ml。離心并重懸于100 μL PBS中，加入CD3-APC(eBioscience，0.25 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.2 mg/ml)抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，以PBS緩沖液洗完2遍后，加入破膜固定工作液1 ml后4度避光孵育30 min。離心后，重懸于100 ul permeabilization buffer中，加入IL-17A-PE(BioLegend，0.25 mg/ml)，4℃避光孵育45min，以PBS緩沖液洗2遍后， 500 μL緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)。

1.2.2ELISA法檢測(cè)兩組人群血清中IL-17、IL-6、TGF-β1水平：人的IL-17、IL-6、TGF-β1試劑盒均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，檢測(cè)流程嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

1.2.3采用RT-PCR法檢測(cè)兩組人外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT的mRNA水平：外周血離心后提取上層血漿200 μl，加入到1 ml Trizol充分勻漿，按照說(shuō)明書(shū)的要求抽提總RNA，所得RNA溶于30μl DEPC水中。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。然后再采用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃20s和70℃1 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。RORγT引物序列：正義序列：5’-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3’， 反義序列：5’-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3’；內(nèi)參GAPDH引物序列：正義序列：5’-GCATGGGTCAGAAGGAT TCCTc-3’， 反義序列：5’-TCGTCCCAGTTGGTG ACGAT-3’。使用ABI公司的7300型號(hào)Real-Time PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，所得結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析[10]。

1.3 骨密度測(cè)量

應(yīng)用美國(guó)通用PRODIGY雙能X線吸收儀檢測(cè)測(cè)定 L1-4椎體、股骨頸、橈骨遠(yuǎn)端的骨密度BMD值，以面積骨密度值準(zhǔn)確性(0.5%-1%)g/cm表示。腰椎1-4，股骨頸和橈骨遠(yuǎn)端檢測(cè)的變異系數(shù)(CV)分別為1.2%，1.2%，1.4%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)及作圖分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者及對(duì)照人群外周血Th17細(xì)胞水平比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)正常對(duì)照組人群外周血中Th17細(xì)胞比例為(0.67±0.39)%，顯著低于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中的Th17細(xì)胞比例(2.10±0.83)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.08,P=0.000)。提示Th17細(xì)胞可能參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)展。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組人群外周血中Th17細(xì)胞比例(***，P<0.001)Fig.1 The proportion of Th17 cells in peripheral blood in the two groups.

圖2 兩組人群外周血血清中IL-17蛋白水平及外周血RORγT的mRNA水平Fig.2 The levels of serum IL-17 protein and RORγT mRNA in peripheral blood in the two groups.

2.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者及對(duì)照人群血清中IL-17及外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT的mRNA水平

ELISA結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)正常對(duì)照組人群外周血中IL-17水平為(19.51±11.21)pg/ml，顯著低于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中IL-17水平(27.54±10.48)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.05,P=0.000)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與絕經(jīng)后骨質(zhì)正常對(duì)照組人群比較，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血RORγT mRNA水平顯著高于正常人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.12，P=0.001)。提示了Th17細(xì)胞可能通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子RORγT以及分泌細(xì)胞因子IL-17及來(lái)參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)展。見(jiàn)圖2。

2.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者及對(duì)照人群外周血血清IL-6及TGF-β水平比較

ELISA結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)正常對(duì)照組人群外周血血清中IL-6水平顯著低于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.99,P=0.000)；此外，絕經(jīng)后骨質(zhì)正常對(duì)照組人群外周血中TGF-β水平顯著低于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.71,P=0.000)，見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血血清中IL-6及TGF-β的關(guān)系Table 1 Relationship between serum IL-6 and TGF-β

注：與對(duì)照組比較，△t=8.99,P=0.000；▼t=4.71,P=0.000

2.4 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者及對(duì)照人群外周血中Th17細(xì)胞與骨密度的關(guān)系

與對(duì)照組比較，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的BMD顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.14，P=0.000)，見(jiàn)表2。進(jìn)一步Pearson相關(guān)分析顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中IL-17與骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.671，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

表2 兩組外周血中Th17細(xì)胞與骨密度的關(guān)系Table 2 Relationship between Th17 cells in peripheral blood and bone mineral density.

注：與對(duì)照組比較，△t=6.14，P=0.000。

圖3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中IL-17與骨密度的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis of serum IL-17 and BMD in PMOP patients

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是多種原因引起的一類(lèi)以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致骨的脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的一種全身代謝性骨骼疾病。隨著近年來(lái)社會(huì)的老齡化以及生活水平的提高，骨質(zhì)疏松癥的患病率逐年增加。目前的研究認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病的誘導(dǎo)機(jī)制主要包括雌激素缺乏、維生素C、D缺乏、甲狀腺功能亢進(jìn)癥以及胃腸吸收功能障礙等[11, 12]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種因絕經(jīng)后卵巢合成雌激素減少導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。研究發(fā)現(xiàn)，婦女絕經(jīng)后機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞因子，如IL-1、TNF-α、IL-6 和巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)水平顯著增加，并與骨丟失密切相關(guān)[13, 14]。

IL-17是一類(lèi)主要由Th17細(xì)胞誘導(dǎo)下產(chǎn)生的細(xì)胞因子，IL-17在抵抗胞外病原體感染的宿主防御以及各種自身免疫性疾病發(fā)病中發(fā)揮極其重要的作用[15, 16]。在骨關(guān)節(jié)炎模型研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可以通過(guò)與 TNF-α的協(xié)同作用共同參與關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)及骨轉(zhuǎn)換過(guò)程[7]。DeSelm CJ等在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷卵巢切除術(shù)(OVX)的野生型小鼠由于雌激素缺失可以導(dǎo)致骨小梁減少，而IL-17受體缺失的小鼠卻具有較完整的骨小梁[17]，從而提示了IL-17在雌激素缺失的小鼠中可能具有促進(jìn)骨質(zhì)疏松作用。本研究通過(guò)對(duì)人群樣本研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血中Th17細(xì)胞及IL-17水平顯著高于對(duì)照人群，提示Th17細(xì)胞可能通過(guò)產(chǎn)生IL-17參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的免疫應(yīng)答，這與以往研究發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞在雌激素(estrogen，E2)缺失的小鼠體內(nèi)水平增加與骨丟失一致的結(jié)果相符[18]。我們進(jìn)一步檢測(cè)了RORγT的mRNAs水平，該指標(biāo)是Th17細(xì)胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中RORγT的mRNA水平均高于對(duì)照人群，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)果。由于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和IL-6在誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[20]，因此，本研究亦觀察了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)以上兩種細(xì)胞因子水平，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血中TGF-β及IL-6水平顯著高于對(duì)照人群。Islander U 等學(xué)者在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的IL-6 具有促骨質(zhì)疏松特性[21]，且Grainger, D.J等學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGF-β在美國(guó)的骨質(zhì)疏松婦女血清中表達(dá)增加[22]，均支持了本研究的結(jié)果。

目前關(guān)于Th17分泌的IL-17影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的機(jī)制尚未完全明了，因此，我們通過(guò)分析了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)IL-17水平與骨密度的關(guān)系，探討IL-17對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中IL-17越高，骨密度越低，從而提示了IL-17可能通過(guò)影響骨密度參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病的過(guò)程。

綜上所述，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松致病中發(fā)揮著重要的功能，Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子的增加，可能是促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因，降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)增加的IL-17可能對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療及預(yù)后具有重要的臨床意義。