陳林 薛純純 舒冰 王擁軍

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032

TNF-α是由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，其在干細(xì)胞向成骨分化過程中起著重要的作用——促進(jìn)或抑制干細(xì)胞向成骨分化[1-3]。大量研究表明，TNF-α促進(jìn)或抑制干細(xì)胞向成骨分化的過程與多條信號通路相關(guān)，包括Wingless-type MMTV integration site family members(Wnt)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogehetic protein, BMP)-Smads、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)等信號通路，但何種因素決定TNF-α是促進(jìn)或抑制干細(xì)胞向成骨分化仍存在爭議。近期的研究發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)中不同的TNF-α作用時間、作用濃度及作用的干細(xì)胞類型可對成骨分化產(chǎn)生不同的作用?，F(xiàn)以TNF-α對干細(xì)胞成骨分化作用的相關(guān)信號通路及可能決定因素做一綜述，為后續(xù)的研究提供一定的思路。

1 TNF-α與Wnt信號通路

Wnt信號通路在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向成骨分化過程中起著重要作用[4]，按其對β-鏈蛋白(β-catenin)依賴與否可分為經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/PCP、Wnt/Ca2+信號通路。經(jīng)典Wnt信號通路的配體包括Wnt1～3、Wnt8、Wnt10b等，非經(jīng)典Wnt信號通路的配體包括Wnt4～7、Wnt11等[5]。在經(jīng)典Wnt信號通路中，Wnt配體與其受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)rz)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LDL-receptor-related protein 5/6，LRP-5/6)相結(jié)合，從而抑制β-catenin降解復(fù)合物APC-Axin-GSK3β形成，阻斷β-catenin磷酸化。

未磷酸化的β-catenin即激活的β-catenin在胞質(zhì)中累積并入核，與T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor，LEF)相互作用，促進(jìn)靶基因如C-myc、cyclinD1等表達(dá)促進(jìn)成骨[6]。非經(jīng)典Wnt信號通路同樣可以促進(jìn)細(xì)胞成骨分化[7]，其可通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun N端激酶(JNK)促進(jìn)BMP2表達(dá)促進(jìn)成骨[8, 9]。

TNF-α可通過Wnt信號通路激活其下游成骨因子表達(dá)促進(jìn)干細(xì)胞向成骨分化。TNF-α促進(jìn)人類間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)成骨分化，同時刺激非組織特異性堿性磷酸酶(tissue-non specific alkaline phosphatase, TNAP)表達(dá)并誘導(dǎo)礦化。Dickkopt相關(guān)蛋白1(DKK1)是Wnt信號通路的抑制劑，可與Wnt配體競爭性結(jié)合LRP-5/6阻斷Wnt/β-catenin信號通路[10]。在TNF-α的作用過程中，細(xì)胞內(nèi)DKK1水平增加，β-catenin磷酸化水平無下降，用DKK1或DKK1抑制劑干擾對hMSCs的TNAP及礦化表達(dá)影響均輕微。而給予Wnt5a抑制劑能明顯逆轉(zhuǎn)因TNF-α引起的礦化，同時TNF-α作用于hMSCs后可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Wnt10b和Wnt5a水平，說明TNF-α是通過非經(jīng)典Wnt信號通路促進(jìn)成骨[11]。

2 TNF-α與BMP-Smads信號通路

BMPs為轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族成員，Smads為其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，按其功能可分為受體調(diào)節(jié)型Smad(R-Smads)、共同介質(zhì)型Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smads)。BMPs與其受體結(jié)合后激活R-Smads(Smad1、Smad 5、Smad 8)，活化的R-Smads與Co-Smads(Smad4)形成復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控Runx2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)、Osterix等基因表達(dá)[12]。Runx2是細(xì)胞成骨分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，為BMP2的靶基因，BMPs激活Smads后通過Runx2啟動子AP-1和AP-2啟動Runx2基因轉(zhuǎn)錄[13]。

TNF-α可直接抑制BMP-Smads信號通路或促進(jìn)其下游成骨效應(yīng)分子泛素化來抑制干細(xì)胞向成骨分化。TNF-α可抑制BMPs誘導(dǎo)的Smad1、5、8磷酸化，阻止Smad1-Smad4復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，抑制成肌細(xì)胞C2C12成骨分化[14]。Smurf是E3泛素連接酶家族的成員，可使Runx2及Smad1泛素化而阻斷BMP-Smads信號通路[15]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以顯著上調(diào)C2C12細(xì)胞和2T3細(xì)胞Smurf1和Smurf2水平，促進(jìn)Runx2泛素化，抑制C2C12細(xì)胞和2T3細(xì)胞的成骨分化；用RNA干擾技術(shù)或蛋白酶體抑制劑抑制Smurf1和Smurf2的表達(dá)，則可以逆轉(zhuǎn)TNF-α導(dǎo)致的成骨抑制作用，從而證明TNF-α通過促進(jìn)Runx2泛素化抑制成骨[16]。還有研究利用TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以提高泛素化鏈接酶E3 WW Domain Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase 1(WWP1)的表達(dá)，使AP-1轉(zhuǎn)錄因子JunB泛素化進(jìn)而抑制BMP-Smads信號通路下游的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步抑制bMSCs的成骨分化[17]。

3 TNF-α與MAPK信號通路

MAPK信號通路主要參與細(xì)胞的形成、運(yùn)動、凋亡、分化和生長等過程[18]，其包含4條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、JNK、p38MAPK和ERK5信號通路。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可通過MAPK信號通路下的ERK1/2、JNK、p38MAPK信號通路促進(jìn)或抑制干細(xì)胞成骨分化[19-21]。

如TNF-α干預(yù)脂肪基質(zhì)細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ASCs)后可促進(jìn)ASCs增殖、活化，并上調(diào)其I型膠原蛋白、骨鈣素、Runx2及BMP2的表達(dá)。進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)ASCs的成骨分化與TNF-α誘導(dǎo)的p38、ERK1/2蛋白磷酸化密切相關(guān)。使用ERK1/2抑制劑抑制ERK1/2信號通路可下調(diào)ASCs的BMP2表達(dá)及成骨分化，但抑制p38MAPK信號通路并不能抑制成骨，說明TNF-α通過激活ERK1/2信號通路促進(jìn)ASCs成骨分化[22]。而在人類骨膜細(xì)胞成骨過程中，TNF-α則激活JNK信號通路促進(jìn)成骨分化。TNF-α可誘導(dǎo)人類骨膜細(xì)胞ERK、JNK磷酸化并促進(jìn)其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)表達(dá)，但并不增加Runx2及骨鈣素分泌，JNK信號抑制劑SP600125可減少細(xì)胞ALP的表達(dá)及礦化[20]。

此外在其他研究中也發(fā)現(xiàn)TNF-α可以通過MAPK信號通路抑制干細(xì)胞向成骨分化。在C2C12細(xì)胞和小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化過程中，BMP2可誘導(dǎo)細(xì)胞ALP、鈣沉積和Runx2的表達(dá)，TNF-α能抑制BMP2的作用。但TNF-α不影響Smads蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)及磷酸化，說明TNF-α并非作用于BMP-Smads信號通路。而在TNF-α抑制成骨的同時又伴隨著細(xì)胞內(nèi)p38及ERK1/2蛋白磷酸化水平的增加，使用p38MAPK、ERK1/2信號通路抑制劑SB203580和PD98059能夠顯著改善細(xì)胞Runx2的表達(dá)，說明TNF-α通過p38MAPK和ERK1/2信號通路抑制細(xì)胞成骨分化[21]。

4 TNF-α與NF-κB信號通路

NF-κB信號通路包含兩種激活途徑：經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑[23]。TNF-α主要通過前者介導(dǎo)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。NF-κB是一個由p50、p65兩個亞單位所組成的二聚復(fù)合體，在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制物IκBα以無活性的三聚復(fù)合體形式存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α等炎癥因子刺激時，激活的IKK(IKB kinases)將IκBα磷酸化，繼而IκBα降解，釋放出游離的NF-κB二聚體，游離的NF-κB二聚體從胞漿轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與特異性DNA位點(diǎn)結(jié)合，激活下游靶基因[25]。所以IκBα降解是活化NF-κB的重要因素，減少或抑制IκBα降解可阻斷NF-κB信號通路[26]。

TNF-α可通過激活NF-κB信號通路干擾Wnt信號通路，影響干細(xì)胞的成骨分化。研究發(fā)現(xiàn)在hMSCs成骨分化過程中，TNF-α激活NF-κB信號通路后誘導(dǎo)Smurf1和Smurf2生成，Smurf1、Smurf2促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin泛素化及降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路，減少hMSCs骨鈣素、Runx2及ALP的表達(dá)。使用IKK抑制劑阻斷NF-κB信號通路可逆轉(zhuǎn)TNF-α導(dǎo)致的成骨抑制[27]。

TNF-α也可以通過激活NF-κB信號通路抑制BMP-Smads信號通路，阻止干細(xì)胞向成骨分化。在BMP2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中，TNF-α可抑制MC3T3-E1細(xì)胞的ALP表達(dá)，但TNF-α對Smad1/5/8的磷酸化及Smad1-Smad4復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運(yùn)均無影響。BAY11-7082為NF-κB抑制劑，使用BAY11-7082抑制NF-κB信號通路可逆轉(zhuǎn)TNF-α導(dǎo)致的成骨抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過激活NF-κB信號通路阻斷DNA與Smads結(jié)合至靶基因從而抑制BMP-Smads信號通路[28]。而在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨分化過程中，TNF-α激活NF-κB信號通路后直接抑制Smad1/5/8的磷酸化，影響B(tài)MP-Smads信號通路抑制BMMSCs的成骨分化[29]。

但也有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α激活NF-κB信號通路后也可直接作用于下游成骨因子，促進(jìn)干細(xì)胞向成骨分化。如TNF-α可通過NF-κB信號通路增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells, DPSCs)的BMP2、ALP、Runx2和I型膠原蛋白(Collagen I, COL I)表達(dá)，促進(jìn)DPSCs向成骨分化[30]。

5 TNF-α對成骨分化的相關(guān)因素

從TNF-α與上述信號通路之間的關(guān)系來看，在不同類型的干細(xì)胞中，TNF-α可以通過相同的信號通路對干細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生完全相反的作用；而在同一類型的干細(xì)胞中，TNF-α又可激發(fā)不同的信號通路對其成骨分化產(chǎn)生不同的影響。究竟何種因素影響TNF-α發(fā)揮其促進(jìn)或抑制干細(xì)胞的成骨分化作用值得我們深思。最近的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α的作用時間、作用濃度及作用的干細(xì)胞類型可能是TNF-α作用差異的主要因素(圖1，2)。

圖1 TNF-α促進(jìn)干細(xì)胞向成骨分化Fig.1 TNF-α promotes stem cell osteogenic differentiation注：TNF-α通過激活NF-κB、非經(jīng)典Wnt通路及MAPK信號通路下的ERK1/2、p38MAPK、JNK通路促進(jìn)干細(xì)胞向成骨分化。Note: TNF-alpha activates NF-kappa B, non-canonical Wnt, and MAPK downstream signaling pathway including ERK1 / 2, p38MAPK, and JNK to promote stem cell osteogenic differentiationTNF

圖2 TNF-α抑制干細(xì)胞向成骨分化Fig.2 TNF-α inhibits stem cell osteogenic differentiation注：TNF-α通過激活NF-κB信號通路直接抑制或通過促進(jìn)Smads、β-catenin泛素化，繼而干擾BMP-Smads和經(jīng)典Wnt信號通路抑制干細(xì)胞向成骨分化；或通過MAPK信號通路下的ERK1/2、p38MAPK，或直接抑制BMP-Smads信號通路抑制干細(xì)胞向成骨分化。Note: TNF-α directly inhibits stem cell osteogenic differentiation by activating NF-kappa B signaling pathway, or interferes with BMP-Smads and canonical Wnt signaling pathways by promoting Smads and β-catenin ubiquitination to inhibit stem cell osteogenic differentiation.TNF-α inhibits stem cell osteogenic differentiation by activating MAPK downstream signaling pathway including ERK1/2, p38MAPK or by interfering BMPSmads directly.BMPs：骨形態(tài)發(fā)生蛋白；BMPR：骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TNFR：腫瘤壞死因子受體；LRP-5/6：低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子kappa B；IκBα：核轉(zhuǎn)錄因子kappa B抑制蛋白；Smads：Smad蛋白；Smurf1/2：泛素連接酶Smurf1/2；ERK1/2：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；JNK：c-Jun氨基末端激酶；ALP：堿性磷酸酶；β-catenin：β-鏈蛋白；Runx2：成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2；Osx：成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix；Nucleus：細(xì)胞核 BMPs:bone morphogehetic proteins; BMPR:bone morphogenetic protein receptor; TNF-α:tumor necrosis factor α; TNFR:tumor necrosis factor receptor; LRP-5/6:LDL-receptor-related protein 5/6; MAPK: mitogen-activated protein kinase; NF-κB:nuclear transcription factor kappa B; IκBα:inhibitor of NF-κB; Smads:Smad proteins; Smurf1/2:Smad specific E3 ubiquitin protein ligase 1/2; ERK1/2:extracellular signal-regulated kinases1/2; p38MAPK:p38 mitogen-activated protein kinases; JNK:c-Jun N-terminal kinases; ALP:alkaline phosphatase; β-catenin: Beta-catenin; Runx2:Runt-related transcription factor 2; Osx:Osterix; Nucleus;

5.1 作用濃度

在同一類型的干細(xì)胞中，不同濃度的TNF-α可影響其對干細(xì)胞的成骨分化作用。在肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stromal cells, MDSC)成骨分化過程中，TNF-α對MDSC募集的最佳濃度為1pg/ml，最佳促成骨分化濃度為1ng/ml；當(dāng)TNF-α濃度超過1ng/ml繼續(xù)增加時則抑制骨形成[31]。TNF-α的這種濃度依賴性可能與其在不同濃度時作用的信號通路不同有關(guān)。如高濃度TNF-α(10ng/ml、100ng/ml)可抑制鼠類間充質(zhì)干細(xì)胞ST2細(xì)胞向成骨分化，阻斷NF-κB信號可逆轉(zhuǎn)其對成骨分化的抑制效果；而低濃度的TNF-α(0.01ng/ml、0.1ng/ml)通過MAPK信號通路促進(jìn)成骨，NF-κB抑制劑無阻斷效果[32]。說明在同一類型的干細(xì)胞中，不同濃度的TNF-α選擇性作用不同的信號通路導(dǎo)致促進(jìn)或抑制成骨。

5.2 作用時間

TNF-α對干細(xì)胞的作用時間也是決定其促進(jìn)或抑制成骨的主要因素之一。在ST2細(xì)胞成骨分化過程中，長期(4周)的TNF-α刺激可呈劑量依賴性抑制成骨，抑制NF-κB信號可逆轉(zhuǎn)這種效果，提示長期TNF-α刺激可能是通過NF-κB信號通路抑制成骨；而短時(48小時)的TNF-α刺激卻作用于MAPK信號通路下的JNK信號通路促進(jìn)成骨[32]。

5.3 干細(xì)胞類型

在不同類型的干細(xì)胞中，相同濃度的TNF-α對成骨分化的作用也不同。如TNF-α在10 ng/ml濃度時，促進(jìn)人脂肪基質(zhì)細(xì)胞(human adipose-derived stromal cells, hASCs)和人牙髓干細(xì)胞向成骨分化[2, 30, 33]，卻抑制C2C12、MC3T3-E1、C3H10T1/2及小鼠MSCs向成骨分化[28, 34-37]，這可能是由于不同類型的干細(xì)胞對TNF-α的敏感性不同，導(dǎo)致了相同濃度的TNF-α作用的信號通路有所差異。

此外，在不同類型的干細(xì)胞中，即使TNF-α作用于相同的信號通路，其促進(jìn)或抑制成骨分化的機(jī)制也不完全相同[38，30，28，14]。

最后，許多研究中存在人鼠物種混合使用的情況，如使用鼠源重組TNF-α干預(yù)人類干細(xì)胞，或使用人重組TNF-α干預(yù)鼠源干細(xì)胞，這可能也是影響TNF-α成骨作用差異的因素之一。由于鼠源TNF含有兩種受體：p55(TNFR1)和p75(TNFR2)，而人類TNF只含有p55受體，所以人類TNF-α選擇性結(jié)合p55受體，而鼠源TNF-α可同時結(jié)合兩種受體。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α通過受體p55抑制成骨分化，雖然p75對抑制成骨分化無作用，但它可以增加細(xì)胞對TNF-α的敏感性[34]。此外，即使是同一物種的TNF-α與干細(xì)胞，其成骨作用也會有所不同[1,39]。

TNF-α對干細(xì)胞向成骨分化起著雙重作用，研究其具體機(jī)制對許多疾病的治療有著重要意義：如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中TNF-α抑制骨生成，但在強(qiáng)直性脊柱炎中其又促進(jìn)骨贅生成。而TNF-α的作用時間、作用濃度及作用的干細(xì)胞類型可能是其促進(jìn)或抑制干細(xì)胞成骨分化的決定因素，明確上述因素在TNF-α與干細(xì)胞成骨分化之間的關(guān)系，對深入研究炎癥因子與膜內(nèi)成骨有著重要的作用和意義。