何 歡, 呂 美, 甄廣田, 肇立春

(1. 沈陽市糧油食品科學研究所 科研信息室, 沈陽 110025;2. 沈陽師范大學 糧食學院, 沈陽 110034)

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利用玉米秸稈生產單細胞蛋白關鍵技術研究

何 歡1, 呂 美1, 甄廣田1, 肇立春2

(1. 沈陽市糧油食品科學研究所 科研信息室, 沈陽 110025;2. 沈陽師范大學 糧食學院, 沈陽 110034)

以農作物副產品玉米秸稈為研究對象,采用水解纖維素性能優(yōu)良的綠色木霉(13001)及高產蛋白質的產朊假絲酵母(1769)為發(fā)酵生產菌株共同處理,生產蛋白質含量較高,富含多種礦物元素的單細胞蛋白產品。探討了玉米秸稈預處理方法、綠色木霉接種工藝、纖維素降解工藝、不同氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響,以及單細胞蛋白發(fā)酵工藝,通過對比試驗確定了玉米秸稈最佳的預處理方法為粉碎后加入氨水對玉米秸稈進行預處理、接種6%綠色木霉(13001)產酶效率最高、添加15%纖維素酶曲水解24 h纖維素水解最完全、加入氯化銨作為氮源發(fā)酵糖化效果最好,通過正交試驗確定了單細胞蛋白發(fā)酵的最適工藝條件為加入3倍水,溫度控制在29～31 ℃,起始pH控制在5.5左右,發(fā)酵時間48 h左右。

玉米秸稈; 綠色木霉; 產朊假絲酵母; 單細胞蛋白

0 引 言

蛋白質是人體必需的營養(yǎng)物質,更是生命的物質基礎,是構成細胞的基本有機物[1]。而世界蛋白質資源缺乏的問題已存在多年,生物技術開發(fā)新型蛋白是解決這一問題的重要途徑[2]。另外,由于人們對資源的破壞性開采和利用,對可再生資源利用的研究與開發(fā)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略己在世界各國逐步展開[3]。玉米秸稈是農作物的副產品,是一種可以綜合利用的重要的生物資源[4]。我國是農業(yè)大國,年產農作物秸稈達6億噸[5]。隨著我國農業(yè)生產和農村能源事業(yè)的發(fā)展,剩余秸稈的處理問題日漸凸顯。農民采取簡單焚燒或隨意堆積,這種處理方式不但浪費了自然資源,還帶來了各種危害,如造成空氣污染、土壤結構破壞和交通事故頻發(fā)等,對人類健康和周圍動植物的生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響,這對于資源的合理利用和環(huán)境保護都是極為不利的[6]。因此,利用生物技術處理玉米秸稈研制開發(fā)新型蛋白質產品,不僅解決了農作物副產物低價利用的問題,而且減少了由于焚燒玉米秸稈產生的二氧化碳,同時可以緩解世界蛋白質資源缺乏的現(xiàn)狀[7]。本文著重對玉米秸稈發(fā)酵生產新型蛋白產品—單細胞蛋白的工藝技術進行了研究,以期研究開發(fā)出蛋白質含量高、營養(yǎng)豐富的新型蛋白產品,為我國單細胞蛋白工業(yè)化生產提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

綠色木霉13001:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;產朊假絲酵母1769:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;玉米秸稈,麩皮,瓊脂粉,硫酸銨,稀硫酸,NaOH,氨水,氯化銨,硝酸銨,蛋白胨,酵母浸膏等均為市售。

DHP型恒溫培養(yǎng)箱:上海精密儀器儀表有限公司;EHG-B型搖床培養(yǎng)箱:江蘇金壇市億通電子有限公司;FW100型粉碎機:上海楚定分析儀器公司;ES-315型高壓滅菌鍋:上海賽洋實業(yè);SC-3614型離心機:安徽中科中佳儀器公司;HS.Z68.5型蒸餾水發(fā)生器:北京科學儀器;101A-2型數(shù)顯鼓風干燥箱:吳江新億陽烘箱制造廠;MZB-35型糖度計:上海米青科實業(yè)有限公司;PHS-3C型酸度計:上海雷磁儀器廠;接種環(huán)等。

1.2 測定方法

蛋白質的測定:GB 5009.5—2010食品安全國家標準食品中蛋白質的測定第一法規(guī)定的方法測定[8]。

還原糖的測定[9]:3,5-二硝基水楊酸比色法。

纖維素酶活的測定:以新華定量濾紙50 mg/份、羧甲基纖維素鈉510 mg/份、脫脂棉花50 mg/份為底物,分別對應FPA、Cx、β-glucosidase,采用DNS還原糖法測定纖維素酶活[10]。酶活單位的定義為:1 min由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3 工藝流程

1.3.1 纖維素酶曲制備工藝流程

首先接種綠色木霉(13001)制備纖維素酶曲,工藝流程如下:

綠色木霉→斜面培養(yǎng)基→孢子懸浮液↓培養(yǎng)基配料→滅菌→冷卻→培養(yǎng)→纖維素酶曲

1.3.2 發(fā)酵工藝流程

在處理后的玉米秸稈粉中加入一定比例的纖維素酶曲,并接種產朊假絲酵母(1769)進行單細胞蛋白制備,工藝流程如下:

纖維素酶曲↓玉米秸桿→預處理→處理后秸桿粉→接種→發(fā)酵→單細胞蛋白↑產朊假絲酵母→培養(yǎng)→液體菌種

2 結果與分析

2.1 原料預處理

玉米秸稈粉碎后,過20目篩,分別采用氫氧化鈉、稀硫酸、氨水進行處理,結果如表1所示。

表1 玉米秸稈預處理結果對比表Tab.1 Contrast table of Maize straw pretreatment results

由表1可知,通過氫氧化鈉、稀硫酸、氨水的處理后,玉米秸稈分別有不同程度的水解,這種水解有助于后續(xù)水解發(fā)酵反應;氨水處理后反應液得糖率最高,稀硫酸處理最低,這是因為氨水在處理反應過程中,不僅能夠中和玉米秸稈中潛在的酸性,還可以使更多的木質素成分分解,得到更多的糖,而且從經濟及環(huán)保角度考慮,酸處理和強堿處理對設備的耐腐性要求較高[11],還會對環(huán)境造成污染,氨水腐蝕性小,價格便宜,適合工業(yè)化大規(guī)模生產,并且氨水預處理后的液體還可以在后續(xù)發(fā)酵反應中再利用,節(jié)省氮源,減少對環(huán)境污染,綜合考慮,最終選擇氨水對玉米秸稈進行預處理。

2.2 綠色木霉(13001)接種量對產酶效果的影響研究

圖1 木霉接種量對產酶的影響Fig.1 Effect of trichoderma inoculatin volume on enzyme production

在三角瓶中按2∶1的比例加入玉米秸稈和麩皮,加入2%的(NH4)2SO4,分別接種綠色木霉孢子懸浮液2%、4%、6%、8%、10%,在30 ℃條件下培養(yǎng)72 h后測定酶活,實驗結果如圖1所示。

由圖1可以看出,隨著綠色木霉接種量的增加,酶活逐漸升高,當綠色木霉接種量超過6%時,酶活開始下降,這主要是由于接種量過大,會使反應液中微生物的數(shù)量過多,造成曲溫升高的過高,不利于反應液中的微生物正常生長和產酶。因此,本實驗最終選擇的綠色木霉(13001)接種量為6%。

2.3 纖維素酶對玉米秸稈纖維素降解的研究

在玉米秸稈粉中分別加入纖維素酶曲5%、10%、15%、20%、25%,在55 ℃、pH值為5.0條件下[12],水解12、24、36、48、60、72 h,考察對玉米秸稈中粗纖維的降解率,實驗結果如表2所示。

表2 纖維素酶對玉米秸稈中粗纖維降解的研究Tab.2 Tresearch on Cellulose enzyme decomposition of crude fibre in the maize straw

由表2可以看出,當纖維素酶曲添加量為15%,降解24 h以上,玉米秸稈中的粗纖維得到最大程度的降解,從生產工藝與經濟的角度考慮,本實驗最終選擇添加15%纖維素酶曲,水解24 h。

2.4 不同氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響研究

玉米秸稈中是不含氮素營養(yǎng)的[13],所以本實驗在玉米秸稈發(fā)酵糖化之前分別加入硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、硝酸銨和酵母浸膏,并以經過氨水預處理不加其他氮素營養(yǎng)的玉米秸稈為對照,觀察這5種氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響,實驗結果如表3所示。

表3 不同氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響結果Tab.3 The influence results of different nitrogen source on maize straw saccharification fermentation

由表3可以看出,加入蛋白胨產生的還原糖最多,加入酵母浸膏的次之,加入氯化銨發(fā)酵糖化僅比上述2種有機氮源略少,從降低生產成本角度考慮,本實驗最終選擇氯化銨為最佳氮源。

2.5 產朊假絲酵母發(fā)酵實驗結果分析

2.5.1 酵母接種量對產蛋白的影響

圖2 酵母接種量粗蛋白含量的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation volume on crude protein content

分別接入5%、10%、15%、20%的產朊假絲酵母進行發(fā)酵實驗,經過48 h后,測定發(fā)酵液中蛋白的含量,實驗結果如圖2所示。

由圖2可以看出,隨著產朊假絲酵母接種量增加,產生蛋白的量隨之增加,當接種量達到10%～15%時,產生蛋白的量達到最大值,當接種量再增加,蛋白的含量隨之減少,這主要是由于接種量在適當范圍時,產朊假絲酵母正常發(fā)酵代謝產生蛋白,當接種量超過一定范圍時,酵母代謝旺盛,使發(fā)酵液升溫過高,這對產朊假絲酵母的生長繁殖是不利的,會抑制產朊假絲酵母的生長繁殖代謝。因此,本實驗最終選擇產朊假絲酵母的接種量為10%～15%。

2.5.2 產朊假絲酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化實驗

產朊假絲酵母的發(fā)酵結果受反應固液比、反應溫度、pH值、反應時間4個因素的影響,采用一組四因素三水平正交試驗對發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。試驗方案和試驗結果如表4和表5所示。

表4 正交試驗因素與水平Tab.4 Factors and levels of Orthogonal experiment

表5 正交試驗結果Tab.5 Results of Orthogonal experiment

由表4和表5可以看出,產朊假絲酵母發(fā)酵反應最優(yōu)條件為A2B2C3D1,即反應固液比為1∶3,反應溫度為30 ℃,pH值為5.5,反應時間為48 h;各因素對發(fā)酵反應的影響由大至小依次為發(fā)酵反應溫度、pH值、反應時間、反應固液比。

3 產品質量標準[14]

3.1 感官指標

色澤:淡黃色。

狀態(tài):成粉末狀,無結塊現(xiàn)象。

滋味與氣味:具有產品特有的滋味和氣味,無其他異味。

雜質:無正常視力可見的外來雜質。

3.2 理化指標

蛋白質≥55.0%,鈣≥750 mg/kg,磷≥12.0%,鐵≥48.0 mg/kg,鋅≥259 mg/kg。

3.3 微生物指標[15]

菌落總數(shù)≤10cfu/g,大腸菌群<30MPN/100g,酵母菌<10cfu/g,致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌)未檢出。

4 結 論

通過單因素實驗、正交試驗和方差分析的方法對玉米秸稈發(fā)酵生產新型蛋白產品—單細胞蛋白的工藝進行了研究,確定了玉米秸稈最佳的預處理試劑為氨水;綠色木霉(13001)最佳的接種量為10%～15%;玉米秸稈發(fā)酵最佳氮素營養(yǎng)為氯化銨;產朊假絲酵母(1769)發(fā)酵反應最佳工藝條件為加入3倍體積水,調節(jié)初始pH值為5.5左右,在30 ℃條件下,發(fā)酵反應48 h。在上述工藝條件下制備的新型蛋白產品—單細胞蛋白中蛋白含量達到55%。

[ 1 ]闞建全. 食品化學[M]. 北京:中國農業(yè)大學出版社, 2002:146-147.

[ 2 ]劉國鈞,王連成. 圖書館史研究[M]. 北京:高等教育出版社, 1979:15-18.

[ 3 ]郭雪山,肖玫. 單細胞蛋白的應用及其開發(fā)前景[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2006(5):23-24.

[ 4 ]梁新紅. 微生物降解玉米秸稈生產單細胞蛋白的研究[D]. 楊凌:西北農林科技大學, 2003.

[ 5 ]劉起麗,張建新,葛文嬌,等. 一株產纖維素酶真菌的篩選及其對秸稈的降解效果研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014(6):82-86.

[ 6 ]梁新紅,常景玲. 作物秸桿生產單細胞蛋白的研究概況[J]. 山西食品工業(yè), 2003(3):5-9.

[ 7 ]李立偉,聶麥茜. 微生物發(fā)酵木質纖維素類物質生產單細胞蛋白質的研究狀況[J]. 山西能源與節(jié)能, 2007(1):29-30.

[ 8 ]王中風,曾凡坤,楊幼慧. 單細胞蛋白發(fā)展狀況及作為食物的前景[J]. 四川食品與發(fā)酵, 1994,21(2):14-17.

[ 9 ]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. 食品安全國家標準,食品中蛋白質的測定:GB 5009.5—2010[S]. 北京:中國標準出版社, 2010.

[10]張永華. 食品分析[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 2004.

[11]LECHNER B E,PAPINUTH V L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw[J]. Process Biochem, 2009,41:594-598.

[12]殷海成. 玉米芯發(fā)酵生產單細胞蛋白初步研究[J]. 飼料資源, 2011(5):41-42.

[13]劉曉晶,李田,翟增強. 纖維素酶的研究現(xiàn)狀及應用前景[J]. 安徽農業(yè)科學, 2011(4):1920-1924.

[14]UGALDEN U,CASTRILLO J,KHACHATOURIANS,et al. Single Cell Proteins from Fungi and Yeasts[M]∥Agriculture and food production, Elsevier Science & Technology, 2002:123-150.

[15]中華人民共和國質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. 飼料添加劑飼用活性干酵母(釀酒酵母):GB/T 22547—2008[S]. 北京:中國標準出版社, 2008.

[16]高玉榮,劉洋,李大鵬,等. 大豆糖蜜高產單細胞蛋白菌株的篩選及其生長條件[J]. 中國釀造, 2010(8):33-36.

Research on key techniques of production of single cell protein from maize straw

HE Huan1, LYU Mei1, ZHEN Guangtian1, ZHAO Lichun2

(1.Research Information Room, Shenyang Grain and Oil Food Science Research Institute, Shenyang 110025, China; 2. College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Using maize straw as main research objects, the hydrolysis of cellulose with excellent performance of Trichoderma viride(13001) and high-yield protein of Candida utilis yeast strains(1769) for fermentation production processing together,producting the single cell protein products of high protein content and rich in various mineral elements. Discussed the pretreatment methods of maize stalk, the inoculation technology of green wood mold, the cellulose degradation process, the effects of different nitrogen sources on the fermentation of maize straw and single cell protein fermentation process, by contrast experiments, the best pretreatment method of maize stalk was pretreated by adding ammonia, the highest efficiency of enzyme production was adding 6% trichoderma viride(13001), the hydrolysis of 24 h with the addition of 15% cellulase was the most complete, the best effect of the fermentation was added ammonium chloride as the nitrogen source were determined, by orthogonal test to determine the optimum fermentation technological conditions of single cell protein is added in 3 times of water,temperature controlled in 29～31 ℃,starting pH at about 5.5, fermentation for 48 hours.

maize straw; trichoderma viride; candida utilis; single cell protein

2016-01-15。

沈陽市科技局科學事業(yè)費科技專項項目(2008017)。

何 歡(1982-),女,河北青龍人,沈陽市糧油食品科學研究所高級工程師; 通信作者: 肇立春(1966-),女,遼寧丹東人,沈陽師范大學教授。

1673-5862(2016)03-0311-05

TS210.9

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.03.012