夏海英，肖雯靜，薛茗月

(1.廣西師范大學(xué)電子工程學(xué)院，廣西桂林541004； 2.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

?

微流控芯片下的單細(xì)胞輪廓定位與提取

夏海英1，肖雯靜1，薛茗月2

(1.廣西師范大學(xué)電子工程學(xué)院，廣西桂林541004； 2.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

摘要：微流控芯片可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析，而對(duì)單個(gè)細(xì)胞分析，能夠掌握更準(zhǔn)確更全面的細(xì)胞信息，可以克服以往群體分析中平均結(jié)果對(duì)個(gè)別信息掩蓋的局限性，對(duì)疾病的早期預(yù)防和診斷具有重要的科學(xué)意義。本文根據(jù)早期癌癥細(xì)胞通過微流控芯片中的彎道時(shí)變形與正常細(xì)胞不同的理論，采用Grabcut和Snake相融合的單細(xì)胞圖像分割算法來精確定位和提取單細(xì)胞輪廓，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的形變分析。首先，本文在圖像分割之前引入Perona-Malik模型，增強(qiáng)圖像邊緣的同時(shí)減弱噪聲，使定位更加準(zhǔn)確。其次，利用Canny和Snake模型獲得Grabcut初始化矩形框。最后，通過Grabcut算法實(shí)時(shí)精確地提取單細(xì)胞輪廓。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本文算法結(jié)合了Snake算法和Grabcut算法的優(yōu)點(diǎn)，在無人工交互的條件下，細(xì)胞輪廓平均正確分割率達(dá)到93.7%，能夠滿足醫(yī)學(xué)單細(xì)胞分析的要求。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)渭?xì)胞；輪廓定位與提取；Grabcut算法；Snake算法；融合

0引言

美國(guó)華盛頓大學(xué)的分析化學(xué)家NormanDovichi認(rèn)為，在癌癥的發(fā)展過程中， 同種細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組分差異會(huì)越來越大。如果這種情況屬實(shí)的話，細(xì)胞之間的巨大差異能夠提示疾病更具有擴(kuò)散的趨勢(shì)。對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析可以幫助研究人員區(qū)分單一細(xì)胞系種群和具有不同蛋白組分的多細(xì)胞系種群，這種區(qū)分差異的檢測(cè)技術(shù)將對(duì)癌癥、糖尿病等疾病的研究產(chǎn)生重要影響。2012年，Jason等人通過大量的實(shí)驗(yàn)分析，提出了早期癌癥細(xì)胞在通過微流控芯片彎道時(shí)，與正常細(xì)胞的變形存在不同，并給出了理論分析，即細(xì)胞發(fā)生癌變后，細(xì)胞膜變厚[1]。但細(xì)胞圖像分割具有邊界模糊(甚至無邊界信息)、內(nèi)部灰度分布極其不均、紋理復(fù)雜等特點(diǎn)。那么對(duì)單個(gè)細(xì)胞輪廓的準(zhǔn)確分析就變得相當(dāng)重要。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者針對(duì)此問題也進(jìn)行過很多研究。2008年Yangqihua等人提出基于Curvelet算法和Snake模型相結(jié)合的快速細(xì)胞輪廓提取算法[2]，但是算法復(fù)雜程度高，實(shí)時(shí)性差；馬競(jìng)鋒等人利用偽中值雙邊濾波和水平集函數(shù)結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞分割[3]，但細(xì)胞邊緣分割效果精度較差，因?yàn)椴皇撬械募?xì)胞邊緣都是規(guī)則圓潤(rùn)的；蘭紅等人提出分水嶺優(yōu)化的Snake模型肝臟圖像分割，適用于腹部MR圖像及肝臟圖像等一些面積較大、特征較明顯的圖像[4-5]，對(duì)細(xì)胞圖像的提取分割精度較差；Rother等提出Grabcut算法以后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者為了得到更加精確的圖像分割又對(duì)Grabcut算法進(jìn)行了一系列的研究。陳浩等提出基于Grabcut和八方向鏈碼法的藻類細(xì)胞輪廓提取算法[6]，該算法能夠屏蔽細(xì)胞內(nèi)部雜亂的紋理，較好地保留圖像邊緣信息，但是用戶交互復(fù)雜程度高，不適合細(xì)胞輪廓的實(shí)時(shí)提取；Tangchunming以遺傳算法為基礎(chǔ)提出植物莖細(xì)胞的精確輪廓提取[7]，提取效果和細(xì)胞原圖差異較大，不適用于醫(yī)學(xué)圖像的研究；陳林偉等人提出結(jié)合顯著性的Grabcut及在骨髓細(xì)胞中的應(yīng)用[8-9]，算法能避免以往細(xì)胞分割算法，如支持向量機(jī)、K-means等參數(shù)調(diào)整問題，自動(dòng)化程度顯著提高，但分割效果精確性差且運(yùn)行時(shí)間很慢，不能滿足癌細(xì)胞的早期診斷要求。

考慮到當(dāng)前細(xì)胞輪廓提取算法對(duì)于邊界模糊、紋理復(fù)雜的細(xì)胞圖不能夠達(dá)到精確、實(shí)時(shí)的分割效果，本文提出以微流控芯片為主要平臺(tái)，融合Snake模型的非交互Grabcut分割算法。該算法通過Snake算法快速定位單細(xì)胞的粗略位置，結(jié)合Grabcut算法實(shí)時(shí)精確提取單細(xì)胞輪廓。同時(shí)，為了消除圖片中亮點(diǎn)噪聲的影響，采用PM算法對(duì)原細(xì)胞圖像進(jìn)行處理，進(jìn)一步提高了分割精確度。

1材料與方法

本文實(shí)驗(yàn)中所有樣本均由廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)樣本的獲取以微流控芯片分析儀為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，利用了微流控芯片技術(shù)以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征的特點(diǎn)和它在細(xì)胞學(xué)研究方面的優(yōu)越性。單細(xì)胞成像分析時(shí)，采用類似于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣方式，采樣針下探接近裝有細(xì)胞的試管底部，試管被加壓， 樣品開始流動(dòng)。流動(dòng)室有一方形通道，加壓的鞘液流從低部進(jìn)入該通道， 從上方流出。當(dāng)鞘液流通過該通道時(shí)， 樣品液被射入鞘液中間， 被鞘液流包圍， 但不相互混合。鞘液流的壓力使樣品液流聚集， 鞘液裹挾著的樣品流中的細(xì)胞排成單列， 微流控芯片的通道直徑通常在10～100μm， 與單個(gè)生物細(xì)胞在尺度上具有相似性。細(xì)胞可逐個(gè)通過微流控芯片通道，到達(dá)檢測(cè)窗口時(shí)被檢測(cè)，并采集圖片204幅，圖片格式為BMP，大小為1 024×1 256像素。對(duì)其中的一部分細(xì)胞進(jìn)行熒光染色(熒光染色是指細(xì)胞在熒光染料的作用下產(chǎn)生的熒光顏色)，得到64幅染色后的圖片。圖1所示是單細(xì)胞成像分析進(jìn)樣系統(tǒng)示意圖，圖2是采集得到的單細(xì)胞圖像。

圖1　單細(xì)胞成像分析進(jìn)樣系統(tǒng)示意圖(流式細(xì)胞進(jìn)樣)Fig.1　Single cell imaging analysis injection system diagram

圖2　微流控芯片下采集到的單細(xì)胞圖像Fig.2　Single cell image acquisition

2融合Snake的Grabcut細(xì)胞輪廓自動(dòng)提取算法

首先，采用PM模型對(duì)圖像進(jìn)行平滑和去噪；其次，用Canny和Snake結(jié)合的算法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞圖像的粗定位；最后，利用細(xì)胞輪廓的粗定位對(duì)Grabcut算法初始化，使得本方法不僅能夠得到準(zhǔn)確的單細(xì)胞輪廓，而且滿足了實(shí)時(shí)性要求。具體算法流程如下：

目標(biāo)：經(jīng)過多次迭代使得對(duì)背景和目標(biāo)建模的GMM參數(shù)最優(yōu)，從而使能量E(α，k，θ，z)最小化(見公式(1))得到最優(yōu)分割效果。

E(α，k，θ，z)=U(α，k，θ，z)+v(α，z)，

(1)

式中：U為區(qū)域項(xiàng)；v為彩色圖像平滑項(xiàng)；α為不透明度，α∈[0，1]，0為背景，1為前景目標(biāo)；θ為本幅圖像前景目標(biāo)與背景的灰度直方圖，θ={h(z，α)，α=0，1}；z為圖像灰度值數(shù)組[8]。

Step1：自動(dòng)生成初始化矩形。

①利用PM模型對(duì)原始圖像進(jìn)行平滑，增強(qiáng)邊緣，去除噪聲。

②為了防止圖像中的噪聲點(diǎn)會(huì)誤導(dǎo)Snake朝其移動(dòng)，使Snake被吸引到虛假邊緣處，對(duì)去噪后的圖像利用Canny邊緣檢測(cè)算子進(jìn)行細(xì)化邊緣，生成一副與原圖像大小相同的二維灰度圖像。

③根據(jù)②中Canny得到的細(xì)化邊緣估計(jì)Snake的初始蛇點(diǎn)，然后依據(jù)Snake模型的原理進(jìn)行迭代運(yùn)算(見公式(2))，當(dāng)新蛇相對(duì)于舊蛇沒有變化時(shí)，即Eint=Eimage，則停止迭代，最終得到一系列連續(xù)點(diǎn)組成的細(xì)胞初始輪廓線。

(2)

其中：Eint表示主動(dòng)輪廓的內(nèi)部能量，用來控制Snake的能量向內(nèi)部收縮；Eimage表示外部能量，用來將Snake曲線吸引到圖像明顯的外部特征上，在分割過程中起到了重要的作用。

圖3　算法流程圖Fig.3　Algorithm flowchart

④按從上到下的順序逐行掃描，獲得③中組成初始輪廓線的所有點(diǎn)的坐標(biāo)。經(jīng)過對(duì)比，分別找出x、y軸上坐標(biāo)最小的點(diǎn)作為矩形框的左上角的點(diǎn)，同理，找出x、y軸上坐標(biāo)最大的點(diǎn)作為矩形框的右下角的點(diǎn)，然后把(x.max-x.min)、(y.max-y.min)分別作為框的長(zhǎng)和寬畫矩形。

⑤得到的矩形框匹配原來在圖像上手動(dòng)選定約束矩形框可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)標(biāo)注的目的，框外的區(qū)域?yàn)楸尘皡^(qū)域Tb，框內(nèi)的區(qū)域?yàn)槲粗獏^(qū)域Tu，Tf為目標(biāo)區(qū)域。

⑥Tb內(nèi)的像素點(diǎn)的α值為0，Tu內(nèi)的為1，Tf則設(shè)為空。

Step2：微流控芯片技術(shù)下單細(xì)胞的輪廓提取。

①通過k-means算法初始化前景與背景的GMM模型，每組高斯混合模型的高斯函數(shù)分量為5。

②把每個(gè)像素分配到合適的GMM模型中，分配原則是將每個(gè)像素代入到每個(gè)高斯分量中，最小值所在的高斯分量就是該像素對(duì)應(yīng)的那個(gè)分量kn(見公式(3))。

D(αn，kn，θ，zn)=-logp(zn|αn，kn，θ)-logv(αn，kn)，

kn=argminDn(αn，kn，θ，zn)，

(3)

其中p(·)是高斯概率分布，v(·)是該高斯模型的樣本數(shù)在總樣本中的權(quán)值。

③學(xué)習(xí)優(yōu)化GMM的參數(shù)θ(見公式(4))。

θ=argminU(α，k，θ，z)。

(4)

⑤重復(fù)步驟②～④，直到收斂，GMM參數(shù)確定。

⑥采用bordermatting對(duì)分割邊界進(jìn)行優(yōu)化，就可以得到目標(biāo)的分割結(jié)果。

依據(jù)以上算法步驟，可以得到融合Snake的Grabcut細(xì)胞輪廓自動(dòng)提取算法的流程圖(如圖3所示)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

為了評(píng)估本文算法的性能，將本文算法和Snake模型、Grabcut算法在2種細(xì)胞圖像集中進(jìn)行對(duì)比分析。實(shí)驗(yàn)一的單細(xì)胞圖像采自標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞圖像庫(kù)(http：//www.cellimagelibrary.org/images)，實(shí)驗(yàn)二的單細(xì)胞圖像采自微流控芯片實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)三是對(duì)3種算法分割效果的定量實(shí)驗(yàn)分析。其中實(shí)驗(yàn)一、二是在WindowsXP操作系統(tǒng)平臺(tái)上，采用VS2010工具和Opencv相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)時(shí)將Canny算子的上下限分別設(shè)置為15、40，Grabcut算法的迭代次數(shù)均設(shè)為5。實(shí)驗(yàn)三是在Matlab2011b實(shí)驗(yàn)平臺(tái)下得到的仿真結(jié)果。

3.1標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)下單細(xì)胞圖像分割

我們共對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)50幅單細(xì)胞圖片進(jìn)行了性能測(cè)試，圖4是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)網(wǎng)站上的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果：前3列是干凈背景下的細(xì)胞圖，后2列是復(fù)雜背景下的細(xì)胞圖。

分析以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Snake算法運(yùn)用在細(xì)胞輪廓提取上易受虛假邊緣的干擾，檢測(cè)精確度較低。grabcut算法容易出現(xiàn)欠分割現(xiàn)象。本文改進(jìn)算法能到達(dá)到最佳分割效果(如圖4(a)、(b)、(c)、(d))。但是，在細(xì)胞圖背景極復(fù)雜且包含大量輪廓時(shí)本文算法的精確度將有所下降(如圖4(e))。

(a)為早期胚胎細(xì)胞；(b)為骨髓細(xì)胞；(c)為受精卵細(xì)胞；(d)為真核細(xì)胞；(e)為肌細(xì)胞。圖4　標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)內(nèi)單細(xì)胞輪廓提取結(jié)果對(duì)比Fig.4　Single cell of Standard cell library contour extraction results contrast

3.2微流控芯片技術(shù)下單細(xì)胞圖像分割

實(shí)驗(yàn)二包括60幅單細(xì)胞圖，圖5是對(duì)在微流控芯片平臺(tái)下采集得到的細(xì)胞圖像進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果：其中30幅染色的單細(xì)胞(如圖5前3列)，30幅非染色細(xì)胞圖(如圖5后2列)，

(a)、(b)、(c)為染色單細(xì)胞，(d)、(e)為未染色單細(xì)胞。圖5　微流控芯片下單細(xì)胞輪廓提取結(jié)果對(duì)比Fig.5　Single cell contour extraction results contrast of microfluidic chips

圖5實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Snake模型容易出現(xiàn)細(xì)胞邊緣檢測(cè)斷裂、不能夠完整檢測(cè)出邊緣的問題，Grabcut算法需要用戶交互操作，易受到用戶主觀意思的影響分割出錯(cuò)誤的細(xì)胞邊緣。本文算法能夠?qū)崿F(xiàn)非交互的自動(dòng)分割，分割單細(xì)胞圖像的精度大大提高(如圖5(a)、(b)、(c)、(d))。但是，當(dāng)細(xì)胞圖像受到光照不均勻等問題的影響時(shí)，本文算法的分割精度將有所下降(如圖5(e))。

3.3分割算法性能評(píng)估

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)算法分割效果，本文對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)下采樣的30幅圖片和微流控芯片技術(shù)下采樣的30幅圖片又分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果分析，并通過3個(gè)指標(biāo)比較分割性能。

過分割率yOR=Qp/Dp，

欠分割率yUR=Up/Dn，

總體誤差率yER=(Qp+Up)/(Dp+Dn)。

(5)

其中：Qp表示本來屬于該類但沒有分到此類的數(shù)據(jù)點(diǎn)；Dp表示屬于此類的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)；Dn表示不屬于此類的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)；Up表示本來不屬于該類但錯(cuò)誤地分到此類的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)。把30幅圖像用4個(gè)方法進(jìn)行分割后的效果進(jìn)行定量分析，其過分割率、欠分割率、總體誤差率對(duì)比結(jié)果見圖6。

通過以上分析可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)大部分標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞圖(尤其是干凈背景的單細(xì)胞圖)而言，本文算法和Grabcut算法分割效果相當(dāng)，都能夠得到較好的實(shí)驗(yàn)效果，但對(duì)于背景復(fù)雜和微流控芯片下采集到的單細(xì)胞圖而言，本文算法和Snake算法相比，3個(gè)指標(biāo)都顯著降低；和Grabcut算法相比，其過分割率相當(dāng)，但在欠分割率上本文算法明顯低于Grabcut算法。由以上數(shù)據(jù)綜合分析可知本文算法的平均總體正確率達(dá)到93.7%，在4種算法中最高效果最好，能夠達(dá)到醫(yī)學(xué)圖像分析的要求。

圖6　3種分割算法的定量分析對(duì)比圖Fig.6　Quantitative analysis of three kinds of segmentation algorithm comparison chart

4結(jié)論

本文以微流控芯片為研究平臺(tái)，以實(shí)時(shí)獲取單細(xì)胞輪廓為研究目的，提出了融合Snake的Grabcut細(xì)胞輪廓自動(dòng)提取算法。此算法改進(jìn)了傳統(tǒng)的Grabcut算法在單細(xì)胞輪廓提取中自動(dòng)化程度低、分割結(jié)果易受亮點(diǎn)噪聲影響等缺點(diǎn)。首先采用Perona-Malik[10]算法對(duì)單細(xì)胞圖像進(jìn)行平滑的同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞邊緣，然后利用Canny和Snake模型逼近細(xì)胞邊緣獲得Grabcut初始化矩形框。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本文算法分割精確度顯著提高，尤其對(duì)于在微流控芯片分析儀下采集得到的細(xì)胞圖效果更加明顯。所以，能夠滿足單細(xì)胞醫(yī)學(xué)圖像分析。但是如果單細(xì)胞圖像光照不均勻、背景非常復(fù)雜且有大量輪廓時(shí)，本文算法效果將有所下降，還需要更深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]JASONPB，STEFANHH，KARLA，etal.Sortingcellsbysize，shapeanddeformability[J].LabonaChip， 2012，12(6)：1048-1051.

[2]YANGQihua，WANGQiang.Tissuecellboundariesdetectionbasedoncurvelet-basedsnakemodelinelectrorotationbio-chipcontrolsystem[J].IEEEComputerSociety，2008(2)：728-732.

[3]馬竟鋒.細(xì)胞圖像主動(dòng)輪廓分割模型研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2011.

[4]蘭紅，張璐.分水嶺優(yōu)化的Snake模型肝臟圖像分割[J].中國(guó)圖像圖形學(xué)報(bào)，2012，17：873-897.

[5]LID，ZHANGG，WUZ，etal.Anedgeembeddedmarker-basedwatershedalgorithmforhighspatialresolutionremotesensingimagesegmentation[J].IEEETransactionsonImageProcessing，2010，19(10)：2781-2787.

[6]CHENHao.Algaecellcontourextractionalgorithmbasedongrabcutandthe8-directionchaincodeedgetrackingmethod[J].JournalofMechanicalandElectricalEngineering，2010，27(8)：108-111.

[7]TANGChunming.Accurateextractionofcontourinformationfromthecleavageofneuralstemcells[C]//BiomedicalandPharmaceuticalEngineering.Singapore:IEEE, 2006：67-72.

[8]陳林偉，吳向平. 結(jié)合顯著性的GrabCut及在骨髓細(xì)胞圖像分割中的應(yīng)用[J].中國(guó)計(jì)量學(xué)院，2014，25(1)：87-92.

[9]劉毅. 基于圖割的交互式圖像分割算法研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2013.

[10]辛巧，閆萍，盛其榮.基于高斯曲率改進(jìn)的PM模型[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，25(2)：194-197.

(責(zé)任編輯馬殷華)

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.02.008

收稿日期：2015-12-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21327007)；廣西自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(YQ1402)；廣西高等學(xué)?？蒲匈Y助項(xiàng)目；廣西師范大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目

中圖分類號(hào)：TP39

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-6600(2016)02-0054-07

SingleCellContourLocalizationandExtractionunderMicrofluidicChip

XIAHaiying1，XIAOWenjing1，XUEMingyue2

(1.CollegeofElectronicEnginneering，GuangxiNormalUniversity，GuilinGuangxi541004，China；2.SchoolofChemistryandPharmacenticalSciences,GuangxiNormalUniversity,GuilinGuangxi541004,China)

Abstract:The single-cell analysis， achieved on the microfluidic chip， is able to grasp more accurate and comprehensive cells information， has important scientific significance for the prevention and early disease diagnosis. Based on the theories that the deformability of the early cancer cells are different from normal cells when they go around a curve in the microfluidic chip. So a new cell segmentation algorithm， which fuses classical grabcut algorithm with snake algorithm， is proposed to accurately extract a single cell outline， and achieve the deformation analysis of a single cell. Firstly， the morphological operators are used to eliminate small bright spot noise. Secondly， canny and snake algorithm are utilized to get the position of one cell， which can be regarded as the initialization of the grabcut algorithm. Finally， accurate cell contour are extracted by grabcut algorithm. Experimental results show that the proposed algorithm combines the advantages of snake algorithm and grabcut algorithm. In the absence of human interaction， the average correct segmentation rate is up to 93.7%， can meet the medical requirements of single cell analysis.

Keywords:unicellular； contour localization and extraction； Grabcut algorithm； Snake algorithm； fuse

通信聯(lián)系人：夏海英(1983—)，女，山東聊城人，廣西師范大學(xué)副教授，博士。E-mail：xhyhust@gmail.com