左愛萍,張 明,王道平,陶 晨,楊小生

(1.貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽550018；2.貴州省中國科學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002；3.黔南民族醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000)

0 引言

茶葉中多酚類物質(zhì)總稱茶多酚(Tea-Polyphnenols)，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素(EGC)等.其具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老以及降血壓、調(diào)血脂、降血糖等顯著生物活性[1]，是決定茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因子，也是當(dāng)前食品、醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).兒茶素組分的含量測定常用方法有高效液相色譜法、分光光度法、近紅外光譜法等[2-7]，其中高效液相色譜法因分離效果較好、定量準(zhǔn)確而廣泛應(yīng)用于兒茶素類化合物的檢測.

貴州是有機(jī)茶葉之鄉(xiāng).產(chǎn)地環(huán)境優(yōu)越，茶葉口感醇爽、濃厚，但現(xiàn)有研究對(duì)兒茶素類品質(zhì)成分關(guān)注不多，這不利于貴州地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品——黔茶的系統(tǒng)研究.本文采用高效液相色譜法(HPLC)，以甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，考察了方法的穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性及回收率.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；Welch色譜柱ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梅特勒-托利多AG285型電子分析天平,昆山BRANSON200型.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物及試劑

EC、EGC、ECG、EGCG對(duì)照品，成都瑞芬恩生物科技有限公司；甲醇，默克色譜級(jí)；EDTA、抗壞血酸，分析純；磷酸，分析級(jí)；無水乙醇；雙蒸水.

分別將500 mL無水乙醇、50 mL抗壞血酸(10.0 g/L)和50 mL EDTA(10.0 g/L)混合，添加雙蒸水至1000.0 mL，搖勻制得穩(wěn)定溶液，備用.

1.3 供試茶樣

都勻毛尖(黔南都勻)；湄潭翠芽(特級(jí)，遵義湄潭)；蘭馨(遵義湄潭)；鳳岡鋅硒茶(遵義鳳崗)；石阡苔茶(銅仁石阡)；湄潭翠芽(優(yōu)級(jí)，遵義湄潭)；貴定云霧茶(貴定)；毛峰(遵義湄潭)；大寶紅茶(畢節(jié)納雍)；貴州茗茶(遵義湄潭)等均購于貴州茶城.

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相(A相：甲醇，B相：0.1%磷酸)梯度洗脫(見表1)，檢測波長：278 nm；流速：1 mL?min-1；柱溫：35℃，進(jìn)樣量均為5 μL.

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取EC、EGC、ECG、EGCG對(duì)照品適量置于標(biāo)定的5 mL容量瓶，加穩(wěn)定液溶解、定容，制成EC、EGC、ECG、EGCG質(zhì)量濃度分別為56.02、75.11、371.25、392.75 mg/L的混合對(duì)照品溶液.混標(biāo)色譜圖如圖1所示.

2.3 樣品溶液的制備

精密稱取干燥磨成細(xì)粉的茶葉約0.25 g，置于錐形瓶中，加入25 mL 穩(wěn)定液，稱重，水浴加熱回流提取1 h，冷卻，補(bǔ)重.過濾后，吸取5 mL濾液稀釋至10 mL容量瓶中，穩(wěn)定液定容，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析.樣品的HPLC色譜圖見圖2.

圖1 4種兒茶素混合對(duì)照品的HPLC色譜圖

圖2 樣品的HPLC色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系

精密吸取一定量的兒茶素混合對(duì)照品溶液，用穩(wěn)定液梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液.取5 μL注入液相色譜儀中，測定其峰面積，以峰面積值(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)作圖，得到一條不經(jīng)過原點(diǎn)的直線，4個(gè)指標(biāo)的回歸方程見表2，結(jié)果表明，兒茶素進(jìn)樣量在設(shè)定范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

表2 4種兒茶素線性回歸方程

2.4.2 精密度考察

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液作供試樣品，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次5 μL，4種兒茶素峰面積的RSD值(n=5)分別為1.01%、0.32%、2.03%、0.45%.

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取貴州黔南都勻毛尖作供樣品，按前述樣品處理方法制備供試液，分別在0、2、4、8、12、24h測定4種兒茶素峰面積，RSD值分別為0.89%、0.46%、1.66%、0.43%.

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取貴州黔南都勻毛尖細(xì)粉6份，按2.3節(jié)方法制備供試液，測定4種兒茶素含量，RSD值分別為2.57%、2.02%、2.81%、2.32%.

2.4.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果，得知貴州黔南都勻毛尖四種成分中EC和EGC含量較低，ECG)和EGCG含量較高，因此回收率試驗(yàn)分兩組進(jìn)行.每組各6份，按樣品處理方法制成供試溶液，EC、EGC回收率平均值為98.42%、98.74%，RSD值(n=6)分別為3.66%、3.14%.ECG、EGCG回收率平均值為99.53%、101.98%，RSD值(n=6)分別為3.93%、2.01%.

3 結(jié)果

按2.3方法，制備10種黔產(chǎn)名優(yōu)茶葉的供試液(平行2份)，精密吸取5 μL注入液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中兒茶素的含量，結(jié)果見表3.

表3 10種茶葉中4種兒茶素含量

4 結(jié)論

茶多酚的含量是評(píng)價(jià)茶葉的重要指標(biāo)性成分，由于茶多酚不穩(wěn)定，極易氧化，所以試驗(yàn)中添加了EDTA和抗壞血酸作抗氧化劑，試驗(yàn)通過不同提取方法(超聲、回流及索氏提取)和不同提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5 h)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示采用水浴提取1 h即可得到最高提取率.主要考察指標(biāo)具有良好的分離度和線性關(guān)系，本法簡單快速準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，成功地應(yīng)用于都勻毛尖等10種茶葉中4種兒茶素含量的測定，為進(jìn)一步研究其制作工藝和沖泡方法提供參考依據(jù).由于原料、生產(chǎn)工藝及儲(chǔ)存條件的不同均會(huì)引起茶葉中兒茶素含量的變化，且檢測的樣品均來自于市場，批次少.因此,論文中的檢測結(jié)果僅是體現(xiàn)對(duì)本試驗(yàn)方法的論證和探討，茶葉等級(jí)評(píng)定還需結(jié)合香氣、滋味、氨基酸、咖啡因、微量元素等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).