張偉，姬明麗，張軍華，千智斌

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

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紅鰭東方鲀?nèi)ヒ阴；窼IRT3基因的克隆及原核表達

張偉，姬明麗，張軍華，千智斌

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

從紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）肝臟組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴增，獲得SIRT3基因的編碼閱讀框（ORF），用原核表達載體pET32a（+）構(gòu)建pET32a/SIRT3重組質(zhì)粒，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）將重組質(zhì)粒pET32a/STRT3在大腸桿菌Rosetta （DE3）進行誘導(dǎo)表達，并用鎳柱純化融合表達蛋白。結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀SIRT3基因（trSIRT3）ORF區(qū)大小為1 263 bp大小，編碼420個氨基酸。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，獲得1個帶組氨酸（His）標簽的融合蛋白，目的蛋白主要存在于上清溶液中，為可溶性表達。用鎳離子親和層析柱對重組蛋白進行純化，獲得了相對分子質(zhì)量約66 000的重組蛋白。

紅鰭東方鲀；去乙?；福籗IRT3基因；基因克?。辉吮磉_

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信息沉默調(diào)節(jié)因子 2（The silent information regulator 2，Sir2或Sirtuins）蛋白最初是在酵母細胞中發(fā)現(xiàn)的，是一種高度保守的NAD+依賴性去乙?；负虯DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于原核生物和真核生物中［1］，有7個家族成員為Sirt1-7［2］。Sirtuins蛋白家族有很多生物學功能，如細胞周期調(diào)節(jié)［3］、基因表達沉默［4］、新陳代謝［5］、壽命延長［6］和細胞凋亡［7］等。SIRT3是Sirtuins家族中主要定位在線粒體內(nèi)的去乙酰化酶，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的活力及能量代謝等［3］。與野生型相比，在SIRT3敲除的小鼠中，脂肪酸代謝中間產(chǎn)物的濃度發(fā)生異常，肝臟中甘油三酯也明顯增多，但是其肝臟中的脂肪酸吸收以及分解作用正常［8］；用SIRT3缺失小鼠進行饑餓試驗，48 h后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟和血漿中的酯酰肉堿和棕櫚酰肉堿水平明顯升高，脂肪酸β-氧化發(fā)生障礙［9］；對小鼠飼喂高脂食物，發(fā)現(xiàn)肝臟組織中SIRT3的表達量明顯下降，而線粒體蛋白質(zhì)的乙?；缴撸?0］；在棕色脂肪細胞的分化中會存在 SIRT3的誘導(dǎo)表達［11］等。總之，SIRT3在調(diào)節(jié)脂肪代謝過程中發(fā)揮著非常重要的作用。

目前，關(guān)于魚類Sirtuins基因中SIRT1的研究較多，而關(guān)于SIRT3的研究尚少，僅研究了斑馬魚SIRT3基因的克隆及其在肝臟中的表達模式［12］。紅鰭東方鲀是中國沿海地區(qū)養(yǎng)殖的主要品種之一，其肉質(zhì)極為鮮美，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值較高。筆者以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，用RT-PCR技術(shù)克隆了紅鰭東方鲀SIRT3基因的ORF區(qū)序列，并對其進行原核表達及蛋白純化，旨在為深入研究TrSIRT3基因調(diào)節(jié)魚類脂肪代謝的分子機制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

以紅鰭東方鲀?yōu)樵囼灢牧?，取其肝臟組織，用滅菌DEPC處理水進行沖洗，在液氮速凍1 h后取出，放-80 ℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1SIRT3基因的克隆

以大黃魚SIRT3的氨基酸序列（XP_010752299.1）為探針，在河鲀基因組數(shù)據(jù)庫（http：//genome.jgi-psf.org/Takru4/Takru4.home.html）中進行BLAST分析，獲得預(yù)測的紅鰭東方鲀的SIRT3 cDNA序列。

用Trizol試劑（Invitrogen，美國）從肝臟組織中抽提總RNA。以總RNA為模板，用SuperScript Ⅲreverse transcriptase（Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，美國）合成cDNA第1條鏈。根據(jù)預(yù)測的SIRT3基因序列，在ORF區(qū)兩端設(shè)計引物（上游引物為5'-ATGAACAAAAAAGCCCCCCAG-3'；下游引物為5'-TCAGCTGCTGAGCGTGGAC-3'）。RT-PCR擴增條件：95 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物連接于pGEM T-easy載體（Promega，USA），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coli JM109，在含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上篩選用菌落PCR鑒定的陽性克隆。抽提質(zhì)粒后，在生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2生物信息學分析

用DNA Star軟件中的Editseq程序分析核苷酸和氨基酸序列理化性質(zhì)。用http：//www.expasy.ch/網(wǎng)站分析SIRT3氨基酸序列的親/疏水性。用DNA Star軟件子程序MegAlign和ClustalW2.1 Version （http：// clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）對不同物種SIRT3的氨基酸序列進行多序列比對與同源性分析。采用MEGA5.05軟件構(gòu)建Neighbor-Joining分子系統(tǒng)進化樹。用CBS的ProtComp Version 9.0軟件預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位。

1.2.3原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)克隆得到的SIRT3的ORF序列設(shè)計特異引物，上游ES3-F為5'-GAATTCATGAACAAAAA AGCCCCCCAG-3'，下游ES3-R為5'-CTCGAGTC AGCTGCTGAGCGTGGAC-3'，引物對的劃線部分分別為 EcoRⅠ酶切位點和 XhoⅠ酶切位點。RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA模版2.0 μL、10 μmol/L ES3-F 2.0 μL、10 μmol/L ES3-R 2.0 μL、10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、ddH2O 34.0 μL、高保真DNA聚合酶 1.0 μL，總計50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃變性4 min；94℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)。對得到的SIRT3基因PCR產(chǎn)物與pET32a質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切3 h，用瓊脂糖凝膠回收目的基因和載體后用T4DNA連接酶連接，再轉(zhuǎn)化進E.coli JM109，在含氨芐抗性的LB平板上涂布后過夜培養(yǎng)。菌落PCR和雙酶切鑒定篩選陽性克隆后，對重組質(zhì)粒進行測序驗證。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pET-32a/SIRT3。

1.2.4重組質(zhì)粒pET32a/SIRT3的誘導(dǎo)表達、純化及SDS–PAGE分析

將測序后被鑒定為正確的pET-32a/SIRT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Rosetta（DE3）中，涂布于平板后過夜培養(yǎng)，用菌落PCR鑒定陽性克隆，將克隆接種到含氨芐的 LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h，按1∶50的比例轉(zhuǎn)接到20 mL培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.8～1.0 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)5 h后離心，收集菌體，將菌體放入冰上用超聲波處理后，在 4 ℃下10 000×g離心 20 min，將上清液轉(zhuǎn)到新離處理心管。上清液部分按His-Bind Purification Kit試劑盒操作說明進行純化，將表達產(chǎn)物和純化產(chǎn)物同時用SDS-PAGE進行電泳檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1SIRT3基因的序列測定結(jié)果

根據(jù)電子克隆獲得的序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴增后，電泳檢測到目的條帶（圖1）符合預(yù)期SIRT3基因的ORF區(qū)的大小。測序結(jié)果表明，該序列的全長為1 263 bp。用DAN Star軟件推測獲得的紅鰭東方鲀SIRT3基因ORF序列的氨基酸序列（圖2），發(fā)現(xiàn)其編碼氨基酸420個，該蛋白質(zhì)的理論等電點為8.10，預(yù)測紅鰭東方鲀SIRT3蛋白的理論相對分子質(zhì)量為45 480。氨基酸成分分析結(jié)果顯示，酸性氨基酸有42個，占10.0%；堿性氨基酸有45個，占10.71%；極性氨基酸（S、T、Y、C、Q、 N）有121個，占28.81%，非極性氨基酸（A、F、I、L、V、W）有136個，占32.38%。由以上結(jié)果可知，非極性氨基酸的比例略高。TrSIRT3蛋白中有保守KIV與GIP重要的功能域（圖1）。用ProScale在線軟件進行分析，可以判定SIRT3蛋白為親水性蛋白。用ProtComp Version 9.0在線軟件分析亞細胞定位，推斷紅鰭東方鲀SIRT3蛋白定位于線粒體（表略），與哺乳動物的亞細胞定位一致。

圖1　RT–PCR擴增電泳圖譜Fig. 1 Electrophoretogram from PCR amplification of gene SIRT3

圖2　紅鰭東方鲀與其他物種SIRT3的氨基酸比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences of trSIRT3 to others

2.2紅鰭東方鲀SIRT3的同源性及系統(tǒng)進化分析結(jié)果

將紅鰭東方鲀SIRT3蛋白的氨基酸序列與其他物種進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀與大黃魚、尼羅羅非魚、梭子魚、半滑舌鰨、綠頭鴨、兔子、小鼠、豬、牛、裸鼢鼠及人的同源性分別為78.3%、76.5%、73.8%、69.5%、55.1%、55.1%、49.5%、49.4%、48.0%、47.1%及46.6%（表1）。用Mega5.0以鄰位相接（N-J）構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹（圖3），進化樹總體分為2支：魚類為1支；哺乳類動物聚為另外1支。在魚類這1支中，紅鰭東方鲀與大黃魚先聚在一起，故紅鰭東方鲀與魚類的親緣關(guān)系較近（與大黃魚的親緣關(guān)系最近），與哺乳動物的親緣關(guān)系較遠。

表1　紅鰭東方鲀與其他物種SIRT3的同源性Table 1 Homology comparison between amino acid sequence of SIRT3 from Takifugu rubripes and other species

圖3　紅鰭東方鲀SIRT3與其他生物的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree for the evolutionary relationships between various SIRT3

2.3重組表達載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

用EcoRⅠ和XhoⅠ對pET32a/SIRT3重組表達質(zhì)粒進行雙酶切鑒定（圖4），1條為載體，1條為目的條帶。測序結(jié)果表明，所測序列沒有堿基缺失及變異，故初步確認所構(gòu)建的pET32a/SIRT3重組表達質(zhì)粒是成功的。

圖4　 重組質(zhì)粒pET32a/SIRT3的酶切分析結(jié)果Fig.4 Restriction analysis of plasmid pET32a/SIRT3

2.4融合蛋白及純化蛋白的SDS–PAGE電泳結(jié)果

將pET-32a/SIRT3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta （DE3），與空質(zhì)粒pET32a的陰性對照相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在上清液和沉淀中均出現(xiàn)相對分子質(zhì)量約66 000的蛋白條帶，與推測的融合蛋白的相對分子質(zhì)量相當，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒中未見相應(yīng)的蛋白條帶（圖5）。表達的目的蛋白主要以可溶蛋白形式存在，在沉淀中含有部分目的蛋白，據(jù)此，可初步推斷SIRT3在大腸桿菌中獲得成功表達。用鎳柱純化的融合蛋白通過SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)只有1條相對分子質(zhì)量約66 000的目的蛋白（圖5），說明純化成功，已獲得重組表達蛋白。

圖5　重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物的SDS–PAGE分析結(jié)果Fig.5 SDS–PAGE analysis on the expression of SIRT3 in Rosetta (DE3)

3　結(jié)論與討論

SIRT3是Sirtuins家族中定位于線粒體的NAD+依賴性去乙酰化酶［13］，參與調(diào)控動物的脂肪代謝。目前，國內(nèi)對魚類Sirtuins基因家族的研究尚少，張偉等［14-15］克隆紅鰭東方鲀SIRT1基因的ORF區(qū)并對其進行了原核表達，并獲得了紅鰭東方鲀FoxO1的融合表達蛋白。紅鰭東方鲀SIRT3的氨基酸序列上含2個特異性保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，即KIV和GIP，它們是SIRT3蛋白調(diào)控基因沉默關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域［16］。該研究進行亞細胞定位預(yù)測，紅鰭東方鲀SIRT3同樣定位在線粒體中，與哺乳類動物一樣，因此，推測紅鰭東方鲀SIRT3基因可能在線粒體中調(diào)控能量代謝及ATP的產(chǎn)生，從而影響著糖脂代謝。

pET系統(tǒng)因其所帶標簽小，純化方便，pET-32a（+）載體的N端含有編碼6個組氨酸標簽（6×His-Tag）的序列，鑒定與純化蛋白較為方便［17-18］。在本研究中，將紅鰭東方鲀SIRT3基因克隆到原核表達載體pET-32a（+），構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-32a/SIRT3，然后用IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌中的表達，通過原核表達，為進一步研究紅鰭東方鲀SIRT3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供了參考依據(jù)。

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責任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Cloning and prokaryotic expression of silencing deacetylase SIRT3 gene from Takifugu rubripes

Zhang Wei， Ji Mingli， Zhang Junhua， Qian Zhibin
（School of Basic Medical Science， Xinxiang Medical University， Xinxiang， Henan 453003， China）

In order to further study the function of gene SIRT3 in Takifugu rubripes， the full-length open reading frame（ORF） of gene T. rubripes SIRT3 （trSIRT3） was amplified from total RNA in their liver tissue through reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The recombinant expression vector pET32a/SIRT3 was generated from the prokaryotic expression vector pET32a （+） derived from sub-cloned ORF， then， it was transformed into E.coli Rosetta （DE3）. As the result of IPTG induction， SIRT3 was successfully expressed in E.coli Rosetta （DE3）. Result of sequence analysis showed that the ORF of SIRT3 was 1 263 bp and encoded with 420 amino acids. The prokaryotic expression system of recombined vector pET-32a/SIRT3 was successfully constructed. From the results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis showed that the recombinant protein had an approximate molecular weight of 66 000， which was consistent with the theoretical molecular weight. The fusion protein with tag His， was mainly detected in the supernatant.

Takifugu rubripes； silencing deacetylase； SIRT3 gene； gene cloning； prokaryotic expression

張偉（1977—），男，河南新鄉(xiāng)人，博士，講師，主要從事水產(chǎn)化學與生物技術(shù)研究，zhangwei0920@163.com

Q786；S917

A

1007-1032（2016）04-0424-05

2016-01-15 修回日期：2016-04-20

河南省教育廳重點項目（14A310027）；新鄉(xiāng)醫(yī)學院高學歷人才啟動基金（505001）