朱丹麗，王曉清*，曾志南，秦溱，熊鋼，曾丹，嚴璐琪

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德415000；3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000；4.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127）

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3個群體方斑東風(fēng)螺線粒體COI基因的遺傳多樣性分析

朱丹麗1，2，王曉清1，2*，曾志南3*，秦溱1，2，熊鋼1，4，曾丹1，2，嚴璐琪1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德415000；3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000；4.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127）

采用 PCR產(chǎn)物直接測序法對來自福建東山、廣東湛江和廣西北海的 3個群體方斑東風(fēng)螺(Babylonia areolata）的COI基因進行比較分析。結(jié)果表明：COI基因片段長度為680 bp，堿基組成顯示A+T比例較高，約為62.42%；種群間多態(tài)位點數(shù)為32，單倍型多樣性指數(shù)為0.707±0.092，核苷酸多態(tài)性指數(shù)為0.001 85±0.000 39，平均核苷酸差異數(shù)為1.252。以泥東風(fēng)螺（Babylonia lutosa）和織紋螺（Nassarius）為外群，構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓撲結(jié)構(gòu)顯示，3個群體的方斑東風(fēng)螺首先聚類到一起，然后與泥東風(fēng)螺聚為一支，與織紋螺形成不同的分支。

方斑東風(fēng)螺；COI基因；單倍型；遺傳多樣性

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

方斑東風(fēng)螺（Babylonia areolata）簡稱東風(fēng)螺，俗稱花螺，隸屬于腹足綱，新腹足目（Neogastropoda），蛾螺科（Buccinidae），東風(fēng)螺屬（Babylonia）［1］。在中國主要分布于福建、廣東、廣西和海南等省的沿海地區(qū)［2］，是中國境內(nèi)分布的幾種東風(fēng)螺中個體較大、生長較快、抗病能力強的一種優(yōu)質(zhì)貝類。近年來，由于市場需求量增加，過度捕撈造成方斑東風(fēng)螺的自然資源銳減［3］。方斑東風(fēng)螺現(xiàn)已發(fā)展成為新興的海水養(yǎng)殖對象，在中國的海南、廣東和福建等省，方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖行業(yè)呈上升趨勢。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是承載線粒體遺傳密碼的物質(zhì)，主要呈雙鏈環(huán)狀。mtDNA表現(xiàn)為母系遺傳，進化速度快且不易發(fā)生重組現(xiàn)象。動物體內(nèi)的線粒體基因（mtDNA）是唯一的核外遺傳信息載體，嚴格遵守母系遺傳，已被廣泛應(yīng)用于多種動物類群的系統(tǒng)進化研究。細胞色素氧化酶I亞基（cytochrome oxidasesubunit I，COI）是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員。由于COI基因變異較大［4］，其序列已被廣泛應(yīng)用于貝類的種質(zhì)鑒定［5-6］、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析［7］和分子系統(tǒng)發(fā)育分析［8］等領(lǐng)域。

筆者對福建東山、廣東湛江和廣西北海3個群體方斑東風(fēng)螺的線粒體COI基因進行克隆和分析，并對其遺傳變異進行比較研究，分析其序列組成特性、系統(tǒng)關(guān)系以及序列多態(tài)性，旨在為進一步研究其遺傳分析、種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)進化等提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物

試驗用方斑東風(fēng)螺采自福建東山（DSYF）、廣東湛江（ZJYF）和廣西北海（BHYF）3個地區(qū)，采集數(shù)量分別為 27、25、22個，且均為養(yǎng)殖群體。測定采集樣品的形態(tài)指標(biāo)，然后進行編號，放入-20 ℃冰箱保存。

1.1.2試劑

總DNA提取采用索萊寶柱式動物DNA OUT試劑盒，PCR擴增用Mix為全式金提供的2*Easy Taq PCR Supermix（+dye），切膠回收為全式金提供的EasyPure Quick Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒。

1.1.3引物

COI基因引物序列為L1490（5'-GGTCAACAA ATCATAAAGATATTGG-3'）和H2198（5'-TAAAC TTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'）［9］，均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取

取方斑東風(fēng)螺腹足約100 mg，按照索萊寶柱式動物 DNA OUT 試劑盒提示的操作步驟提取總DNA?？侱NA 用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存，備用。

1.2.2目的片段的PCR擴增和測序

PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，其中DNA模板1 μL，正反引物各0.5 μL，Mix 12.5 μL，加水至25 μL。

PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖電泳、切膠和回收純化后，送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.2.3序列分析

測序獲得的片段先用BLAST在線比對，確定片段的可靠性，然后由 Clustral［10］進行多重比對分析，并用DNAman軟件分析序列長度和計算堿基組成，用DnaSp 4.0［11］軟件分析多態(tài)數(shù)位點（singleton polymorphic sites）、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd） 、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi） 等遺傳多樣性參數(shù)，最后以泥東風(fēng)螺（Babylonia lutosa）和織紋螺（Nassarius）為外群，用MEGA6.0［12］軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行同源性分析和遺傳距離分析。

2　結(jié)果與分析

2.13個群體方斑東風(fēng)螺COI基因片段的堿基組成

通過PCR擴增，經(jīng)過雙向直接測序，測得COI基因的序列長度約為710 bp。通過在線BLAST比對，證實所得序列為方斑東風(fēng)螺COI基因片段。通過Clustal X多重序列比對分析后，除去引物及部分雜合序列，最終獲得大小約為680 bp的COI基因片段。

由表1可知，3個群體方斑東風(fēng)螺COI基因序列中的堿基組成均顯示A+T所占比例較高，存在著明顯的A/T堿基偏向，并且C的含量最低。

表1　3個群體方斑東風(fēng)螺COI基因片段的堿基組成Table 1 The base composition of COI gene fragments from three different groups of Babylonia areolata

2.2序列多態(tài)性分析結(jié)果

遺傳多樣性檢測結(jié)果如表2所示。3個群體間存在的多態(tài)位點數(shù)為 7～18，單倍型多態(tài)性指數(shù)為（0.459±0.119）～（0.840±0.078），核苷酸多態(tài)性指數(shù)為（0.000 76±0.000 23）～（0.002 52±0.000 49），平均核苷酸差異數(shù)為 0.519～1.710。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示：3個群體方斑東風(fēng)螺的核苷酸多樣性指數(shù)以東山方斑東風(fēng)螺的最低，以北海方斑東風(fēng)螺的最高。北海養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性最高，其次是湛江養(yǎng)殖群體，東山養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性最低。

表2　3個群體方斑東風(fēng)螺COI基因片段的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters of COI gene fragments among three different groups of Babylonia areolata

由表3可知，在3個群體方斑東風(fēng)螺的COI基因序列中檢測出了28個單倍型，不計插入和缺失，共發(fā)現(xiàn)了32個變異位點，其中簡約信息位點5個，轉(zhuǎn)換位點數(shù)30個，顛換位點數(shù)2個，平均轉(zhuǎn)顛換比為15。轉(zhuǎn)換方式以A-G（12個）為主，C-T（8個）其次，然后是T-C（6個），G-A（4個）最少；顛換方式只有G-C（2個）。由表4可知，具有單倍型Hap1的個體有40個，為優(yōu)勢單倍型；具有單倍型Hap26的個體有4個；具有單倍型Hap10和Hap16的個體均有3個；其余單倍型均為1個個體。從方斑東風(fēng)螺COI基因序列的組成來看，群體間的單倍型交流較少。東山群體的樣本數(shù)雖然最多，但是其單倍型數(shù)最少；北海群體樣本數(shù)雖然最少，但其單倍型數(shù)最多。

表3　3個群體方斑東風(fēng)螺COI基因的單倍型及變異位點位置Table 3 Haplotypes and variable loci of COI gene in three different groups of Babylonia areolata

表3　(續(xù))

表4　3個群體方斑東風(fēng)螺COI基因的共享單倍型個體數(shù)Table 4 Number of shared haplotypes of COI gene in three different groups of Babylonia areolata

2.3遺傳距離與聚類分析結(jié)果

由表5可知，東山群體內(nèi)遺傳距離為0.001，湛江群體內(nèi)遺傳距離為 0.002，北海群體內(nèi)遺傳距離為0.003，3個群體間的遺傳距離為0.002～0.005。3個群體方斑東風(fēng)螺與泥東風(fēng)螺的遺傳距離為0.127～0.129，與織紋螺的遺傳距離為0.181～0.183。

表5　3個群體方斑東風(fēng)螺及其外群之間COI基因的遺傳距離Table 5 Distance matrix among three different groups of Babylonia areolata and outgroups on COI gene fragments

拓撲結(jié)構(gòu)顯示3個養(yǎng)殖群體的方斑東風(fēng)螺首先聚類到一起，然后與泥東風(fēng)螺聚為一支，與織紋螺形成不同的分支。3個群體之間無明顯分化現(xiàn)象。本結(jié)果與遺傳多樣性指數(shù)分析結(jié)果相一致。貝葉斯推斷樹相應(yīng)節(jié)點的后驗概率值為0.001～0.099。

圖1　3個群體方斑東風(fēng)螺COI基因的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 NJ phylogenetic trees based on COI gene fragments from three different groups of Babylonia areolata and outgroups

3　結(jié)論與討論

對于任何一個物種而言，遺傳多樣性越豐富，說明該物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力和擴展種群分布范圍的能力越強［13］。3個養(yǎng)殖群體方斑東風(fēng)螺的COI基因序列堿基組成均顯示較高的A+T比例，這與蘇天鳳等［5］對來自粵東和粵西方斑東風(fēng)螺和來自臺灣東風(fēng)螺的線粒體16S rRNA和COI基因片段的序列分析結(jié)果基本一致，且與其他貝類COI基因的分析結(jié)果也一致［13-17］。Folmer等［9］認為，A+T含量高的線粒體基因在進化中更具優(yōu)勢。本研究中，3個群體方斑東風(fēng)螺的A+T占比為62.42 %，說明該物種具有較高的遺傳變異能力和進化優(yōu)勢，但其遺傳多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示其具有較低的遺傳多樣性。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因：一方面是由于長期人工繁殖導(dǎo)致親螺的親緣關(guān)系越來越接近，減少了地理隔離造成的遺傳分化；另一方面是因為方斑東風(fēng)螺自身的奠基者效應(yīng)或近期發(fā)生的瓶頸效應(yīng)。此外，人類活動對方斑東風(fēng)螺生存環(huán)境的影響也不容忽視，如對方斑東風(fēng)螺棲息環(huán)境的破壞和近年來的過度捕撈，使野生種群日趨縮小［18］，導(dǎo)致方斑東風(fēng)螺遺傳多樣性水平較低。

3個群體方斑東風(fēng)螺的核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 85±0.000 39。當(dāng)核苷酸多樣性指數(shù)為0.001～0.004 7時，表明該物種種群的遺傳多樣性較低［19］。從遺傳距離來看，3個群體間遺傳距離的差異不明顯。聚類分析結(jié)果顯示，東山群體與湛江群體首先聚類到一起，然后再與北海群體聚到一起，且三者之間無明顯分化。從地理位置看，福建東山臨東海，而廣東湛江和廣西北海地處南海，盡管這與遺傳多樣性指數(shù)和聚類分析結(jié)果不相符，但從整體而言，東海與南海以臺灣島南端和閩粵兩省交界處的連線為界，兩海其實南北相連，都屬北太平洋西部的陸緣海。隨著方斑東風(fēng)螺苗種繁育技術(shù)和成螺養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟，長期人工養(yǎng)殖導(dǎo)致方斑東風(fēng)螺群體內(nèi)的遺傳分化較少，因此，體現(xiàn)出較小的遺傳差異。本研究中的3個群體均為養(yǎng)殖群體，其遺傳差異較小也是符合常理的。

綜上所述，開展方斑東風(fēng)螺種群遺傳多樣性的研究和資源保護刻不容緩。首先，要加強漁政執(zhí)法，規(guī)定起捕規(guī)格，控制捕撈強度，實行嚴格的禁漁期制度，以逐步恢復(fù)方斑東風(fēng)螺的野生資源；其次，應(yīng)開展方斑東風(fēng)螺種群遺傳多樣性研究，以便為其種群保護和遺傳多樣性監(jiān)測提供依據(jù)；最后，建議每年多進行一些野外放流，在苗種養(yǎng)殖場進行人工繁育時盡量采用遺傳距離較遠的親本，避免近交繁育帶來的遺傳衰退，以利于保護其遺傳多樣性。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Genetic polymorphisms of three different groups of Babylonia areolata based on COI gene

Zhu Danli1，2， Wang Xiaoqing1，2*， Zeng Zhinan3*， Qin Qin1，2， Xiong Gang1，4， Zeng Dan1，2， Yan Luqi1，2
（1.College of Animal Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2.Collaborative Innovation Center for Aquatic Efficient Health Production of Fisheries in Hunan Province， Changde， Hunan 415000，China； 3.Fisheries Research Institute of Fujian， Xiamen， Fujian 361000， China； 4.Hunan Biological Electromechanical Vocational and Technical College， Changsha， 410127， China）

We analyzed and compared the polymorphism of mitochondrial COI gene sequence derived from three different groups of Babylonia areolata in Dongshan， Zhanjiang and Beihai by means of PCR. The results showed that the nucleotide sequence of COI gene was 680 bp with a high percentage of A+T base composition （about 62.42%）； there were 32 singleton poylmorphic sites， 0.707±0.092 haplotype diversity， 0.001 85±0.000 39 nucleotide polymorphisms index， and 1.252 average number of nucleotide differences. Taking Babylonia lutosa and Nassarius as outgroups， we built NJ phylogenetic tree， its topology suggested that all the Babylonia areolata clustered together first， then mixed with Babylonia lutosa for one， and finally Nassarius formed independent.

Babylonia areolata; COI gene； phyletic evolution； genetic polymorphism

朱丹麗（1991—），女，上海人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究，463609105@qq.com；*通信作者，王曉清，博士，教授，主要從事水產(chǎn)動物育種研究，wangxiao8258@126.com；*通信作者，曾志南，博士，研究員，主要從事海水養(yǎng)殖和貝類遺傳育種研究，xmzzn@sina.com

Q959.212

A

1007-1032（2016）04-0429-06

2015-11-02 修回日期：2016-06-20

海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（201205021-1）；國家自然科學(xué)基金項目（31372530）