王永翔，劉小榮，趙立明，馬弢業(yè)，劉學(xué)軍，任玉林，薛國強

（甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

膀胱及尿路上皮癌中CD44s的表達及臨床意義

王永翔，劉小榮，趙立明，馬弢業(yè)，劉學(xué)軍，任玉林，薛國強

（甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討CD44s在膀胱及尿路上皮癌中的表達，研究其對膀胱及尿路上皮癌的早期診斷價值。方法 收集膀胱及尿路上皮癌患者70例作為實驗組，收集膀胱黏膜組織正常的患者20例作為對照組，從病理分期和臨床分期兩個方面，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對CD44s進行定量分析。結(jié)果 CD44s蛋白在正常膀胱黏膜上皮無表達，拷貝數(shù)小于1× 102copies/ml。在70例膀胱及尿路上皮癌中，CD44s陽性表達是31例（44.3%），Ct值均小于35，基因拷貝數(shù)均大于1×104copies/ml。CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌TNM分期和WHO病理分級間比較，有顯著性差異P〈0.05）。結(jié)論 CD44s與膀胱及尿路上皮癌的早期診斷具有相關(guān)性，可作為判斷膀胱及尿路上皮癌分化程度、臨床分期的參考指標。

膀胱及尿路上皮癌；CD44s；早期診斷

膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移由腫瘤細胞的多種生物學(xué)行為所決定，其中腫瘤細胞的黏附能力是重要方面。CD44最初被確認為一種淋巴細胞歸巢受體和跨膜糖蛋白，一般表達在胚胎干細胞［1］，在淋巴細胞、成纖維細胞和增生的上皮細胞中都可檢測到，也可見于腫瘤細胞的表面［2］。大量的研究表明，CD44及其變異體在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，與乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膽管癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系［3-4］，而與膀胱及尿路上皮癌的關(guān)系目前仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)從基因水平檢測CD44s在膀胱及尿路上皮癌中的表達，旨在探討CD44s與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后方面的關(guān)系，現(xiàn)介紹如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取本院泌尿外科2010年1月—2014年1月行膀胱部分切除或全切除手術(shù)患者70例作為實驗組，所有病例標本均經(jīng)病理證實為膀胱及尿路上皮癌，其中男56例，女14例；年齡29～83歲，平均56歲；根據(jù)國際抗癌協(xié)會（UTCC）制訂的TNM分期標準，Tis-a期13例，T1期24例，T2期20例，T3期9例，T4期4例；病理I級25例，Ⅱ級23例，Ⅲ級22例；初發(fā)組48例，復(fù)發(fā)組22例；單發(fā)組49例，多發(fā)組21例。正常膀胱黏膜組（對照組）20例，標本取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)患者，經(jīng)病理證實為正常膀胱黏膜組織。

1.2儀器

API7500實時熒光定量PCR儀。

1.3主要試劑

核酸提取液B、Taq酶系、CD44s PCR MIX、CD44s陽性質(zhì)控品、CD44s陰性質(zhì)控品，均來自北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.4實驗過程

1.4.1DNA提取 取約50 mg膀胱黏膜組織轉(zhuǎn)移至1.5 ml干凈離心管中，加1ml生理鹽水混勻，用研磨器研制成勻漿，12000rpm離心5分鐘，棄上清液，沉淀加50 μl核酸提取液（DNA），充分混勻，100℃處理10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清液4 μl 做PCR反應(yīng)。

1.4.2PCR擴增從試劑盒中取出CD44s PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10 000 rpm離心10秒。CD44s引物序列為Forward Primer：GGAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC Reverse Primer GGAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC，測試反應(yīng)體系配置為：CD44s PCR MIX 24 μl、Taq酶系2 μl。向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入26 μl反應(yīng)體系，向每管中加入處理后的樣品或CD44s陽性質(zhì)控品（使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，記為1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml）和陰性質(zhì)控品4 μl，10 000 rpm瞬時離心3秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品以及未知標本，并設(shè)置反應(yīng)體系（30 μl）、樣品名稱，標記熒光基團種類（報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA）和循環(huán)條件：95℃30秒，后95℃5秒，60℃30秒，40個循環(huán)。

1.4.3繪制標準曲線的條件 r值=0.99，CD44s陽性表達值（Ct值）≤35，基因拷貝數(shù)為1×104copies/ml。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS13.0軟件進行方差分析和t檢驗，兩樣本率的比較行χ2檢驗，P〈0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各待測反應(yīng)管曲線圖（見圖1～4）

圖1　TNM分期CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖2　WHO病理分級CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖3　臨床分期CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖4　不同腫瘤數(shù)量CD44s熒光定量PCR曲線圖

2.2CD44s與膀胱及尿路上皮癌的關(guān)系

CD44s在正常膀胱黏膜上皮無表達，在70例膀胱及尿路上皮癌標本中陽性表達31例，陽性率為44.3%。CD44s與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)之間的關(guān)系見表1。

表1　CD44s不同表達在不同TNM分期、不同WHO病理分級、腫瘤是否復(fù)發(fā)及不同腫瘤數(shù)量的人數(shù)分布（人）

結(jié)果顯示，CD44s與膀胱及尿路上皮癌TNM分期的關(guān)系：CD44s的表達在淺表性（Tis-a～T1）與浸潤性（T2～T4）膀胱及尿路上皮癌中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌WHO病理分級的關(guān)系：CD44s表達隨病理分級增加而升高，高分化膀胱及尿路上皮癌（I級）與低分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅱ級、Ⅲ級）之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌復(fù)發(fā)的關(guān)系：CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌是否復(fù)發(fā)的患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌數(shù)量的關(guān)系：CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌單發(fā)和多發(fā)患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

（1）腫瘤的生長依賴于腫瘤細胞與宿主組織外基質(zhì)之間的相互作用。CD44屬于黏附分子家族中的成員，廣泛分布于細胞表面，是一種蛋白形式的細胞表面黏附因子，參與細胞-細胞、細胞-基質(zhì)之間的特異性粘連過程［5］。人類CD44基因位于11號染色體短臂（11p13）上，長約92 kb，至少有21個外顯子，根據(jù)編碼蛋白的表達方式分為兩型：其中10個固定外顯子位于基因兩端，每端5個，轉(zhuǎn)錄時固定表達，其轉(zhuǎn)錄片段存在于所有CD44蛋白中，稱為標準型CD44基因（CD44s）；在固定的外顯子中間有6～15個外顯子僅表達于核RNA的剪接體中，轉(zhuǎn)錄時只存在于一定的CD44轉(zhuǎn)錄子中，表達不固定，稱為變異體CD44v基因，主要包括變異體CD44v1～10［6-7］。

（2）CD44s是存在于多種組織細胞的表面糖蛋白，而CD44v蛋白主要存在于發(fā)育成熟階段的組織器官細胞表面［8］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者通過基因水平、蛋白水平兩個方面檢測尿液中CD44，從而對膀胱腫瘤的分化、浸潤、數(shù)量、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后做了大量的研究。目前關(guān)注較多的主要是 CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10對膀胱腫瘤的診斷。CD44s及CD44v的異常表達與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，但目前仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論，多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果認為：CD44s表達缺失同時伴有CD44v表達增高與腫瘤分化程度較差、分期較晚有顯著關(guān)系［9］。Ross等研究結(jié)果認為，CD44s在膀胱及尿路上皮癌中持續(xù)表達，但在分化差的浸潤性癌中表達下降。Stevevn等［10］研究認為，膀胱及尿路上皮癌組織和正常膀胱黏膜組織中都有CD44s和CD44v2蛋白的表達，結(jié)果CD44v2與腫瘤的分級、分期無關(guān)，認為CD44v2不能作為診斷膀胱癌的指標。

（3）本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR方法，從基因水平檢測了人正常膀胱黏膜及膀胱和尿路上皮癌組織中CD44s的表達，探討了CD44s表達與膀胱尿路上皮癌TNM分期、WHO病理分級、腫瘤數(shù)量及復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果CD44s在正常膀胱黏膜上皮無表達，拷貝數(shù)小于1×102copies/ml。在70例膀胱及尿路上皮癌中，CD44s陽性表達是31例（44.3%），Ct值均小于35，基因拷貝數(shù)均大于1×104copies/ml。CD44s的表達在膀胱及尿路上皮癌TNM分期和WHO病理分級組間比較，有顯著性差異（P〈0.05），CD44s檢測有助于對膀胱及尿路上皮癌的早期診斷，具有臨床診斷價值［11］。

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R195

B

1671-1246（2016）16-0133-03

蘭州市科技計劃項目（2012-1-3）