劉丹，王高頻，常清華，劉義

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基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

原花青素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

劉丹，王高頻，常清華，劉義

目的：觀察原花青素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B型白細(xì)胞/2型淋巴細(xì)胞樣蛋白（Bcl-2）和凋亡相關(guān)基因Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）蛋白表達(dá)的影響，探討原花青素在大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。

方法：40只雄性SD大鼠隨機(jī)等分為4組，即正常組，模型組，原花青素低劑量組［原花青素 50 mg/（kg·d）］，原花青素高劑量組［原花青素 100 mg/（kg·d）］，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)2周。末次給藥后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD） 30 min再灌注 120 min，建立大鼠心肌缺血再灌注模型。測(cè)定肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性、心肌梗死面積；用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。

結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠CK-MB活性顯著增強(qiáng)、心肌梗死面積增大，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax降低（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素高、低劑量組大鼠CK-MB活性顯著減弱、心肌梗死面積減小，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax增加（P＜0.05）。

結(jié)論：原花青素可拮抗缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比例增加有關(guān)。

心肌再灌注；原花青素；細(xì)胞凋亡

Abstract

Objective： To observe the effects of procyanidins on myocardial apoptosis and related protein expressions of caspase-3， Bcl-2 and Bax in experimental rats with ischemia reperfusion （I/R） injury and to explore the possible mechanism.

Methods： A total of 40 male SD rats were randomly assigned to 4 groups： Sham group， IR group， Low-dose procyanidin （50 mg·kg-1） group， and High-dose procyanidin （100 mg·kg-1） group. n=10 in each group and the rats were pre-treated by intra gastric drug administration once/day for 2 weeks， then left anterior descending artery （LAD） occlusion was conducted for 30 minutes followed by reperfusion for 120 minutes to establish IR model. Blood levels of CK-MB activity and myocardial infarction （MI） size were examined； protein expressions of caspase-3， Bcl-2 and Bax were determined by Western blot analysis； myocardial apoptotic index was measured by TUNEL method.

Results： Compared with Sham group， IR group presented the higher CK-MB activity， enlarged MI size， increased index of apoptosis， elevated protein expressions of caspase-3 and Bax， while reduced protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax，P＜0.05. Compared with IR group， both Low-dose and High-dose procyanidin groups had the lower CK-MB activity， smaller MI size，decreased index of apoptosis， reduced protein expressions of caspase-3 and Bax， while elevated protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax， P＜0.05.

Conclusion： Procyanidin could reduce myocardial apoptosis index in experimental IR rats， which might be related to decreased protein expressions of caspase-3 and Bax， increased protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：696.）

急性心肌梗死早期再灌注治療，無(wú)論是溶栓或急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈（冠脈）介入治療，都是心肌挽救最實(shí)用和最廣泛采用的方法［1， 2］。然而，人們發(fā)現(xiàn)在心肌組織血流恢復(fù)后反而出現(xiàn)了組織細(xì)胞損傷加重的狀態(tài)，即缺血再灌注損傷，引起心肌功能障礙及心律失常的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［3］。如何減輕再灌注損傷已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。原花青素是一類(lèi)在植物中廣泛存在的多酚類(lèi)化合物的總稱。近年來(lái)，關(guān)于原花青素的生理活性和藥理作用的研究不斷增多。在心血管系統(tǒng)中，它具有多種生物活性如血管舒張活性、抗氧化、改善內(nèi)皮功能、抗炎、抗血小板聚集等功效［4， 5］。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示原花青素可以通過(guò)抑制活性氧-p53-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（ROS-p53-Caspase-9）途徑明顯減少大鼠心肌缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡［6］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究原花青素通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3和B型白細(xì)胞/2型淋巴細(xì)胞樣蛋白（Bcl-2）、凋亡相關(guān)基因Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白的表達(dá)，保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

材料：2014-09至2016-02選擇健康成年雄性SD大鼠40只，體重250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（遼）2003-0007］。儀器：DH-150型動(dòng)物人工呼吸機(jī)（浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠）；電泳槽（美國(guó)Bio-rad公司）；DNM-9602G酶標(biāo)分析儀（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）；7170A型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。藥品與試劑：原花青素（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20110739，純度：＞95%），原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），兔抗大鼠Caspase-3、Bcl-2、Bax多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），三羥甲基氨基甲烷（TBS，遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供）：三羥甲基胺基甲烷（Tris）12.1 g，Nacl 17.5 g，加雙蒸水至 1500 ml，在攪拌下加濃Hcl至pH 7.4，再加雙蒸水定容至2000 ml。

分組和給藥：SD大鼠40只隨機(jī)分為4組，每組10只：正常組（0.9%氯化鈉鹽水2 ml/ d ）、模型組（0.9%氯化鈉鹽水2 ml/d）、原花青素低劑量組［原花青素 50 mg/（kg·d）］、原花青素高劑量組［原花青素 100 mg/（kg·d）］。每天清晨灌胃，除正常組外，其他3 組2 周后建立大鼠心肌缺血再灌注模型。

模型的建立［7］：SD大鼠用10%烏拉坦（5 mg/kg）行腹腔麻醉后手術(shù)臺(tái)固定，取頸正中切口，分離頸總動(dòng)脈，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)動(dòng)脈插管取血，氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣，于胸骨左旁第2～3 肋間行縱行切口，分離胸大肌及肋間肌，結(jié)扎肋間動(dòng)靜脈，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜。在左心耳下緣冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）起始部處用6.0 聚丙烯紡織纖維線穿線，留線暫不結(jié)扎，待血壓、呼吸穩(wěn)定10～15 min后再收緊結(jié)扎線，結(jié)扎之前在預(yù)結(jié)扎的LAD處放置一根長(zhǎng)約0.5 cm、直徑1.5 mm的乳膠管。LAD 缺血30 min 后再松開(kāi)活結(jié)進(jìn)行再灌注，再灌注120 min。冠脈LAD結(jié)扎成功標(biāo)志：結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺，心電圖表現(xiàn)為ST段進(jìn)行性抬高和（或）T波高聳和（或）QRS高大增寬。再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)：剪斷結(jié)扎線后，心電圖ST段回落50%以上或者缺血部位心肌顏色恢復(fù)［8］。

指標(biāo)測(cè)定：肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性、梗死面積測(cè)定：再灌注結(jié)束后120 min，頸動(dòng)脈插管采血1.0 ml，119 g離心10 min，取血清置于-80℃貯藏，備用。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定CK-MB活性［6］。頸動(dòng)脈取血后，立刻取出心臟，置于生理鹽水中，分離靜脈、動(dòng)脈和左右心室。將左心室稱重，采用氯化硝基四氮唑藍(lán)染色法，分離正常心肌和梗死心肌，分別稱重，計(jì)算心肌梗死面積（即梗死心肌重量占左心室重量的比例）。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率， 再灌注結(jié)束120 min后，取出心臟，將缺血區(qū)心肌組織（左心室前壁中間段）剪下，10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)綠色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取5個(gè)高倍視野，計(jì)算出平均100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)（%）表示凋亡指數(shù)。免疫印跡法（Western blot）測(cè)定Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)：取各組大鼠的心肌進(jìn)行蛋白制樣。取-80℃低溫保存的心肌組織約100 mg，加入1 ml細(xì)胞裂解液，勻漿破碎，4℃下10297 g離心30 min 取上清液，二喹啉甲酸（ BCA） 法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，制成含蛋白量相等的樣品［7］。行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳。然后將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS中封閉，加入一抗，4℃封閉過(guò)夜；第2天，TBS洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下?lián)u床上孵育1 h；按Western blot發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)顯影，用圖像分析軟件Image J計(jì)算各蛋白的相對(duì)光密度值，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

原花青素對(duì)模型大鼠心肌CK-MB活性、心肌梗死面積的影響（表1）：與正常組相比，模型組的CK-MB活性水平、梗死面積顯著增加；與模型組相比，原花青素低劑量組CK-MB活性、梗死面積顯著減少；與原花青素低劑量組相比，原花青素高劑量組CK-MB活性、梗死面積顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 原花青素對(duì)缺血再灌注模型大鼠心肌CK-MB活性、心肌梗死面積的影響（±s， n=10）

表1 原花青素對(duì)缺血再灌注模型大鼠心肌CK-MB活性、心肌梗死面積的影響（±s， n=10）

注： CK-MB：肌酸激酶同工酶；-：無(wú)。與正常組相比*P＜0.05；與模型組相比△P＜0.05；與原花青素低劑量組▲P＜0.05

組別　CK-MB （U/L）　 全心重 （mg） 梗死區(qū)重 （mg） 梗死面積 （%）正常組　978.94±8.56　788.40±9.93　-　-模型組　5045.00±7.83*　733.72±9.54　286.28±10.03　38.97±1.33*原花青素低劑量組　3883.90±10.70△　820.62±6.87　252.57±8.43　30.78±0.83△原花青素高劑量組　2907.30±1.07▲　785.73±9.16　117.44±7.82　15.07±0.82▲

原花青素對(duì)模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響（圖1）：TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加［（4.55±0.62）% vs （21.87±1.00）%，P＜0.05）］；與模型相比，原花青素低劑量組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少［（21.87±1.00）% vs （13.69±0.86）%，P＜0.05）］；與原花青素低劑量組相比，原花青素高劑量組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降［（13.69±0.86）% vs （9.26±0.62）%，P＜0.05）］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡分析方法顯示原花青素對(duì)缺血再灌注模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

原花青素對(duì)模型大鼠心肌組織Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響（圖2A，2B，2C）：與正常組相比，模型組的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯上升，Bcl-2表達(dá)降低，Bcl-2/ Bax比例減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，原花青素低劑量組的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)升高，Bcl-2/ Bax比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與原花青素低劑量組相比，原花青素高劑量組的Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)升高，Bcl-2/ Bax比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 原花青素對(duì)模型大鼠心肌組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是指急性缺血的心肌再恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象［9］。它是由多種炎癥因子及多細(xì)胞信號(hào)通路參與的復(fù)雜的炎癥損傷反應(yīng)，其具體機(jī)制涉及氧化應(yīng)激，線粒體損傷及鈣超載等［10］。研究發(fā)現(xiàn)［11］，細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡的數(shù)量決定心肌細(xì)胞損害的程度。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡［12， 13］，降低心肌梗死的面積，對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是由基因控制的有序化的主動(dòng)死亡過(guò)程，在目前已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2 家族（ B 型白細(xì)胞/2 型淋巴細(xì)胞樣蛋白）在各類(lèi)刺激信號(hào)引起的凋亡中起到關(guān)鍵的作用［14］。包括抗凋亡基因和促凋亡基因兩類(lèi)，其代表分別為Bcl-2基因及Bax基因［15， 16］。Bcl-2 是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，Bax 則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 和Bax 的平衡狀態(tài)與凋亡調(diào)控直接相關(guān)： Bax 增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡； Bcl-2 增高，抑制細(xì)胞凋亡。因而有人提出細(xì)胞在受凋亡刺激后的生存能力由Bcl-2與Bax的比率決定［17， 18］，Bcl-2表達(dá)水平較高時(shí)，比率上調(diào)，可形成Bcl-2/Bax的異二聚體，細(xì)胞凋亡受到抑制；Bax表達(dá)水平較高時(shí)，比率下調(diào)，可形成Bax/Bax同二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspases激活的線粒體途經(jīng)是調(diào)節(jié)機(jī)制比較明確的細(xì)胞凋亡過(guò)程。在Caspases激活的線粒體途經(jīng)中，Caspases家族承擔(dān)著重要的凋亡調(diào)控作用。其中Caspases-3是最重要的凋亡執(zhí)行者。Bcl-2 是通過(guò)干擾細(xì)胞色素C 的釋放而阻斷上游caspase 蛋白酶的激活，抑制細(xì)胞的凋亡［19］。Bax 蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分，使細(xì)胞色素C 得以穿過(guò)線粒體膜，激活Caspase-9，并進(jìn)一步激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。該Western blot結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷模型組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)顯著增高，Bax促凋亡基因表達(dá)增加，Bcl-2抗凋亡基因表達(dá)減少，Bcl-2/Bax比例減少，而預(yù)先加入原花青素可顯著抑制Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，Bax促凋亡基因表達(dá)減少，Bcl-2抗凋亡基因表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比例增加，呈劑量依賴性。提示原花青素可通過(guò)上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Caspase-3、Bax的表達(dá)，增加Bcl-2/Bax比例來(lái)發(fā)揮減輕缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，增加其存活率。

本研究結(jié)果還顯示，不同劑量的原花青素均可顯著降低血清CK-MB活性和心肌梗死面積。證明原花青素對(duì)缺血再灌注過(guò)程中心肌損傷有保護(hù)作用。我們通過(guò)TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡顯示，與正常組相比，模型組、原花青素低、高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，證實(shí)了缺血/再灌注損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。原花青素預(yù)處理低、高劑量組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，說(shuō)明原花青素預(yù)處理有抑制缺血/再灌注損傷所致心肌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，原花青素可以明顯減少缺血再灌注后的心肌細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷，可能與其抑制Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比例有關(guān)。本研究為原花青素能夠減輕再灌注損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但應(yīng)用于臨床，仍需大量臨床實(shí)驗(yàn)。

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（編輯：汪碧蓉）

Effects of Procyanidin on Myocardial Apoptosis and Related Protein Expressions in Experimental Rats With Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

LIU Dan， WANG Gao-pin， CHANG Qing-hua， LIU Yi.
Department of Cardiology， The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College， Jinzhou （121000）， Liaoning， China
Corresponding Author： WANG Gao-pin， Email： lijunchang0802@126.com

Ischemia reperfusion； Procyanidin； Apoptosis

121000 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科（劉丹、王高頻、常清華）； 遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室（劉義）

劉丹 主管護(hù)師 碩士 研究方向?yàn)楣谛牟〉脑\治 Email： lijunchang0802@126.com 通訊作者：王高頻 Email： lijunchang0802@126.com

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1000-3614（2016）07-0696-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.07.018

（2015-08-14）