廖 陽 殷小林 許路路 閆榮玲

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院 永州 425199)

葉片作為光合作用的場(chǎng)所，對(duì)于植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝等生命活動(dòng)意義重大。葉脈是葉片中的維管組織，如同動(dòng)物體內(nèi)的“毛細(xì)血管”，為葉片輸送水分與無機(jī)離子。不同進(jìn)化地位及不同種類植物的葉脈特征存在不同程度差異[1，2]。人們提出了一系列性狀指標(biāo)來表征葉脈的結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)葉片功能的影響[3]。研究表明，葉脈的結(jié)構(gòu)特征一方面會(huì)受到環(huán)境因子如水分、溫度、光照等因素的影響[3，4]；另一方面，葉脈的形態(tài)特征也是植株是否健康的重要表征[5～7]。因此，葉脈分析是植物學(xué)研究的一個(gè)重要要素。作為一種木本油料作物，油茶(Camelliaoleifera)的葉片除了常綠、光滑、邊緣鋸齒等特點(diǎn)外，還表現(xiàn)出葉厚、覆蠟、革質(zhì)等特征，不利于其葉脈的觀察。本文通過對(duì)已有方法進(jìn)行改進(jìn)，摸索建立一種簡(jiǎn)單易行的油茶葉脈顯微觀察的方法，可為開展相關(guān)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)原理

油茶葉片分別置于一定濃度的乙醇和氫氧化鈉溶液進(jìn)行煮沸處理。在煮沸過程中，葉肉細(xì)胞逐漸被破壞，同時(shí)乙醇和氫氧化鈉會(huì)使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)變性，破壞葉片中的色素并對(duì)組織產(chǎn)生腐蝕作用，從而加快了葉肉細(xì)胞的破損速度。前期摸索確定乙醇與氫氧化鈉的濃度分別均為80%與80%。但在此過程中，葉脈作為維管組織，較難破壞而得以保留其形態(tài)與分布特征。

2 實(shí)驗(yàn)材料、器材與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：新鮮油茶葉片。

實(shí)驗(yàn)器材：光學(xué)顯微鏡、恒溫水箱、鑷子、電子天平、容量瓶(500 mL)、燒杯、藥匙、稱量紙、剪刀、玻璃棒、量筒。

實(shí)驗(yàn)試劑：75%乙醇溶液(現(xiàn)配)、80%NaOH溶液(現(xiàn)配)。

3 操作步驟

(1)取新鮮油茶葉片，清水洗凈備用。

(2)將配置好的75%乙醇與80%NaOH溶液，置于恒溫水箱中加熱至沸騰。

(3)將風(fēng)干的新鮮油茶葉片置于煮沸的75%乙醇中，5min后用鑷子取出置干自來水下沖洗至無明顯變化。

(4)再將葉片置于煮沸的80% NaOH溶液中，15～20 min后用鑷子取出置干自來水下沖洗至葉肉全部脫落。若葉肉未能洗脫完全，可再次放入煮沸的NaOH中處理，并根據(jù)情況確定持續(xù)時(shí)間(5～10min)，直至呈現(xiàn)出完整、清晰的葉脈網(wǎng)絡(luò)。整個(gè)過程中不需要其他工具對(duì)被破壞的葉肉進(jìn)行額外處理。

(5)將得到的葉脈用吸水紙輕輕吸干，置于載玻片上進(jìn)行顯微觀察(與拍照)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，經(jīng)上述步驟處理后，在顯微鏡下可以清晰地觀察到油茶葉片的葉脈形態(tài)特征與網(wǎng)絡(luò)分布。從圖上可以看出，油茶葉片的葉脈密度較大，幾乎布滿整個(gè)葉片。根據(jù)葉脈直徑，可明顯分為三級(jí)，分別是Ⅰ級(jí)大葉脈(箭頭所示)，Ⅱ級(jí)：中葉脈(圓圈所示)，Ⅲ級(jí)：細(xì)葉脈(矩形所示)。

圖1 油茶葉片葉脈分布與形態(tài)特征(40倍)

顯示：Ⅰ級(jí)大葉脈(箭頭所示)，Ⅱ級(jí)：中葉脈(圓圈所示)，Ⅲ級(jí)：細(xì)葉脈(矩形所示)。

5 注意事項(xiàng)

(1)試驗(yàn)中用到強(qiáng)堿溶液，在試劑配制以及煮沸過程中要注意安全，防止液體飛濺到皮膚或眼睛。

(2)實(shí)驗(yàn)中若在NaOH溶液持續(xù)煮沸15～20 min后，存在部分葉肉不能直接沖掉的個(gè)別情況時(shí)，只需再次放入延長(zhǎng)煮沸3～5 min即可。

(3)實(shí)驗(yàn)所用試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用。

(4)裝片置載玻片上時(shí)，需小心展平。

6 小結(jié)

油茶葉片的葉片表面覆蓋蠟質(zhì)，且葉片較厚，顏色較深。因此，要獲得完整、清晰、無雜質(zhì)的葉脈臨時(shí)裝片相對(duì)較難。因此，在實(shí)驗(yàn)方案確定過程中，一方面把乳酸或碳酸氫鈉等試劑換成了強(qiáng)堿性的氫氧化鈉[8]。另一方面，加大乙醇與氫氧化鈉的濃度，均達(dá)到或超過75%。由圖可知，這種針對(duì)油茶葉片(以及具有類似特征的植物葉片)的葉脈顯微觀察方法有效可行，所獲裝片的葉肉清除徹底，葉脈完整無損，在顯微鏡下可清晰觀察到葉脈的整體分布，根據(jù)葉脈粗細(xì)可劃分其為不同等級(jí)。值得注意的是，在葉片經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)步驟的處理后，直接在自來水下進(jìn)行沖洗即可去除全部葉肉組織，不需其他額外操作(如用牙刷輔助去除葉肉)，這樣可以最大限度地保護(hù)葉脈的完整性。