兩種介體物質(zhì)在漆酶降解磺胺類抗生素中的作用

丁惠君,吳亦瀟,鐘家有,鄒斌春,張維昊*,樓 倩

?

兩種介體物質(zhì)在漆酶降解磺胺類抗生素中的作用

丁惠君1,2,3,吳亦瀟1,鐘家有2,3,鄒斌春2,3,張維昊1*,樓 倩2,3

(1.武漢大學資源與環(huán)境科學學院,湖北 武漢 430072；2.江西省水利科學研究院,江西 南昌 330029；3.江西省鄱陽湖水資源與環(huán)境重點實驗室,江西 南昌 330029)

通過比較兩種介體物質(zhì)丁香醛(SA)和1-羥基苯并三氮唑(HBT)對漆酶降解5種典型磺胺類抗生素的影響,考察了介體的起始濃度、pH值、反應(yīng)溫度、漆酶起始濃度等因子的影響,得到介體SA對漆酶催化降解磺胺類抗生素的效果更好.在漆酶+SA反應(yīng)體系中,反應(yīng)體系pH值為5~6,反應(yīng)溫度為30℃,SA起始濃度為0.5mmol/L,漆酶起始濃度為0.5mg/mL時,漆酶對5種磺胺類抗生素的降解效果最佳,降解去除率在15min時達到75%左右,1h內(nèi)均達到97%以上. 本研究表明,適當?shù)慕轶w物質(zhì)可大大提升漆酶對磺胺類抗生素的降解效果.漆酶在介體物質(zhì)的作用下對抗生素類污染物的生態(tài)凈化具有良好的應(yīng)用潛力.

丁香醛；1-羥基苯并三氮唑；漆酶；磺胺類抗生素；降解

大量研究表明,抗生素普遍存在于自然環(huán)境中[1].抗生素長期、低劑量存在于環(huán)境中造成的細菌耐藥性問題,被認為是抗生素環(huán)境污染可能產(chǎn)生的最大生態(tài)風險[2-3].傳統(tǒng)的污水處理工藝并不能有效地去除抗生素[4].

漆酶(EC 1.10.3.2)是從紫膠漆樹的分泌物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì),它是一種含銅的多酚氧化酶,一般含4個銅離子,屬于銅藍氧化酶蛋白[5].近十多年來,利用漆酶催化氧化降解有機污染物得到廣泛研究[5-7],漆酶具有氧化底物廣泛、能耗低、效率高、環(huán)境友好等優(yōu)越性能.近年來,開始有報道利用漆酶降解去除抗生素類藥物.Shi等[8]利用FeO微納米顆粒固定化漆酶降解磺胺類抗生素,發(fā)現(xiàn)在介體丁香酸的作用下,固定化漆酶在5min內(nèi)可完全降解3種磺胺類抗生素.Suda等[9]利用游離漆酶處理四環(huán)素類抗生素,在介體HBT的作用下,強力霉素和金霉素在15min內(nèi)被全部去除,而四環(huán)素和土霉素則在1h內(nèi)被全部去除. Migliore[10]用真菌-側(cè)耳去除土霉素的研究表明, 14d內(nèi)土霉素被全部降解.

已有的研究主要針對一種或幾種抗生素進行漆酶催化降解[11-12],取得了較好的降解效果.而環(huán)境水體中抗生素種類繁多,對多種甚至多類抗生素的同時去除是抗生素降解的一個研究方向.本研究探討利用游離漆酶和介體體系同時降解5種磺胺類抗生素磺胺嘧啶(SD)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)和磺胺二甲嘧啶(SMZ)的去除方法,并探討了2種典型反應(yīng)介體物質(zhì)在漆酶降解5種磺胺類抗生素中的不同表現(xiàn)及不同因素對抗生素降解的影響,旨在為水環(huán)境中多類抗生素的同時去除提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

漆酶(Laccase from Tramete,30.5U/mg)和磺胺類抗生素(磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑及內(nèi)標物:磺胺甲基嘧啶-D4*,398.0%,基本性質(zhì)見表1)均購自SIGMA-ALDRICH公司;1-羥基苯并三氮唑(HBT,98%)和丁香醛(SA,98%)均購自J&K公司;檸檬酸(399.5%)和檸檬酸鈉(399.0%)購自國藥集團化學試劑有限公司.其他試劑為分析純以上.

表1 磺胺類抗生素的基本性質(zhì)Table 1 Basic characteristics of sulfonamide antibiotics

光照振蕩培養(yǎng)箱(ZQLY-180GF,上海知楚),紫外可見分光光度計(UV5500,上海普析),pH計(PHSJ-3F,上海雷磁儀器廠),超純水系統(tǒng)(Direct- Q 5UV,Millipore),超高效液相色譜UPLC(安捷倫1290)串聯(lián)三重四極桿二級質(zhì)譜(安捷倫6460).

1.2 實驗方法

1.2.1 磺胺類抗生素的漆酶降解 用甲醇配制濃度為100mg/L的5種磺胺類抗生素的混合母液;漆酶母液用不同pH值的檸檬酸緩沖溶液配置,母液濃度為5mg/mL;用純水配制濃度為5mmol/L的介體HBT和SA母液.

在10mL的反應(yīng)體系中,將漆酶母液、磺胺類抗生素母液、介體母液及緩沖溶液以不同體積混合,獲得不同的反應(yīng)起始條件.在設(shè)置的反應(yīng)條件下以150r/min震蕩反應(yīng)3h,反應(yīng)結(jié)束后加入10mL甲醇進行漆酶的滅活處理[13].測定不同條件下反應(yīng)終止時混合溶液中5種抗生素的剩余含量.在獲得各個參數(shù)的最優(yōu)條件后,進行最優(yōu)條件下的抗生素降解實驗,分別在15,60,120, 180min取樣,進行漆酶滅活后測定各抗生素的剩余含量.各處理組均設(shè)2個平行樣.

反應(yīng)介體的影響:在10mL的反應(yīng)體系中磺胺類抗生素的反應(yīng)濃度設(shè)為10mg/L,介體濃度為0.5mmol/L,漆酶濃度為0.5mg/mL;緩沖溶液采用酶活性較大的pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液.設(shè)置一個不加介體的對照組和一個僅加抗生素的空白對照組.

介體起始濃度的影響:在10mL反應(yīng)體系中,磺胺類抗生素、漆酶反應(yīng)濃度均不變,緩沖溶液為pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液.兩種介體物質(zhì)設(shè)置不同的起始濃度,濃度梯度為0,0.05,0.1, 0.5,1,2mmol/L.

pH值的影響:在10mL反應(yīng)體系,磺胺類抗生素、漆酶和介體物質(zhì)的濃度均不變,通過改變緩沖溶液的pH值來考察不同pH值對反應(yīng)的影響.添加的緩沖溶液pH值的梯度為3,4,5,6,比較在不同pH值緩沖溶液中磺胺類抗生素的去除率.

反應(yīng)溫度的影響:在10mL的反應(yīng)體系中,磺胺類抗生素、漆酶和介體物質(zhì)的濃度均不變,緩沖溶液為pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液.將反應(yīng)體系分別置于不同溫度條件下進行反應(yīng),溫度梯度設(shè)為30 ℃,40℃,50℃,60℃.比較反應(yīng)后體系中磺胺類抗生素的剩余含量,確定反應(yīng)的最佳溫度.

漆酶起始濃度的影響:在10mL反應(yīng)體系中,使漆酶起始濃度分別為0.05,0.1,0.5,1,2mg/mL,磺胺類抗生素和介體物質(zhì)的濃度均不變,緩沖溶液為pH=4的檸檬酸緩沖溶液.

1.2.2 UPLC-MS/MS測定磺胺類抗生素 5種磺胺類抗生素采用UPLC-MS/MS進行檢測分析.色譜柱為Eclipse Plus C18(100mm′2.1mm, 1.8μm, Agilent);流速 0.3mL/min,柱溫 40oC,進樣體積10 μL;流動相:0.2%甲酸的2mmol/L乙酸銨溶液(A)-乙腈(B).測定采用梯度洗脫程序為:0~0.1min,95%~90%A;0.1~1.8min,90%~90%A; 1.8~2.8min,90%~87%A;2.8~6.9min,87%~51%A;6.9~7.5min,51%~95%A.離子化模式為ESI+,掃描模式為多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),干燥氣溫度325℃,干燥氣流量5L/min,鞘氣溫度350℃,鞘氣流量11L/min,霧化器壓力45psi.使用內(nèi)標法進行定量,線性范圍為1~100mg/L,線性良好,精確度高,重復性好.各目標抗生素的母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能量和保留時間等參數(shù)見表2.

表2 各目標抗生素的質(zhì)譜參數(shù)和保留時間Table 2 Target mass spectrum parameters and retention time of antibiotics

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用Origin8.5軟件處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種介體的對比

SA的結(jié)構(gòu)式 HBT的結(jié)構(gòu)式

圖1 兩種介體物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式
Fig.1 The molecular formula of two mediators

本研究所選的丁香醛(SA)和-羥基苯并三氮唑(HBT)(圖1)是2種常見的漆酶催化氧化介體物質(zhì)[14].SA是一種小分子量的酚類化合物, HBT含有N—OH結(jié)構(gòu).漆酶催化氧化它們的機制主要是通過一個氫電子轉(zhuǎn)移,使它們分別產(chǎn)生,在自由基的作用下氧化反應(yīng)底物.

通過在漆酶降解磺胺類抗生素反應(yīng)體系中分別加入SA和HBT兩種介體,比較兩種反應(yīng)介體對磺胺類抗生素的催化氧化促進作用.如圖2所示,相比不加介體的對照組,加入SA和HBT兩種介體對漆酶降解磺胺類抗生素均有促進作用,其中加入SA介體處理組對5種磺胺類抗生素的降解率達到70%~90%,比不加介體的漆酶組和空白組均高出60%~70%左右;比加入HBT介體處理組高40%~60%;加入HBT介體處理組對5種磺胺類抗生素的降解率在16%~45%,略高于空白對照組和純漆酶處理組.由此可見,純漆酶組對磺胺類抗生素在反應(yīng)時長內(nèi)沒有起到明顯的催化氧化作用,而SA對漆酶降解磺胺類抗生素反應(yīng)體系具有較好的促進作用.研究表明[14-15],由于漆酶的氧化還原電位不足以氧化磺胺類抗生素,因此單獨的漆酶對磺胺類的降解作用非常有限.相對于HBT,SA中含有的甲氧基降低了苯氧基的氧化還原電位,同時又增加了其電子密度[8],使得SA更容易被漆酶氧化,發(fā)生氧化還原循環(huán).

漆酶催化氧化底物的機理主要包括:酶分子對底物的作用、電子在酶分子中的傳遞、氧分子對酶分子的氧化[16].漆酶作為氧化還原酶,不僅可以直接氧化底物發(fā)揮催化作用,還可通過介導系統(tǒng)的協(xié)同作用催化其他底物,如圖3.在純漆酶反應(yīng)體系中,氧化態(tài)的漆酶氧化還原態(tài)底物,生成還原態(tài)漆酶和氧化態(tài)底物;還原態(tài)漆酶又被氧氣氧化,生成氧化態(tài)漆酶和水.氧化態(tài)漆酶繼續(xù)氧化還原態(tài)底物.在漆酶介體反應(yīng)體系中,氧化態(tài)漆酶首先從還原態(tài)介體中獲得一個電子被還原,同時介體被漆酶氧化,接著氧化態(tài)的介體氧化還原態(tài)底物,還原態(tài)的漆酶又被氧氣氧化.反應(yīng)不斷循環(huán),直至還原態(tài)底物被全部氧化.

2.3 介體起始濃度的影響

如圖4所示,介體SA和HBT對磺胺類抗生素的降解作用在0~2mmol/L內(nèi)均隨著起始濃度的增加而增大,其中 SA介體對磺胺類抗生素降解的促進作用均優(yōu)于相應(yīng)濃度梯度下的HBT介體.漆酶+SA體系中,5種磺胺類抗生素的降解率最高能達到90%以上.由此可以看出,介體SA對漆酶降解磺胺類抗生素的效果更好.文獻[8]比較了9種木質(zhì)素衍生介體物質(zhì)對漆酶降解3種磺胺類抗生素的作用,發(fā)現(xiàn)S型介體(丁香酸、丁香醛和丁香酮)相對于其他類型介體具有最大的降解去除率.而Kourosh等[18]的研究則表明,在HBT的作用下,漆酶對2種磺胺類的降解去除率分別達到66%和77%.

SA的起始濃度在0.1mmol/L提高到0.5mmol/L后,抗生素的降解率有較大的提升幅度(幅度約為30%),而在0.5,1,2mmol/L下,隨著SA濃度的提升,對磺胺類抗生素的降解去除作用提升幅度較小.考慮高濃度的SA對水環(huán)境具有一定的的毒性(經(jīng)藻類毒性實驗得到其EC50約為100mg/L),確定0.5mmol/L為SA的最佳起始濃度.

2.4 pH值的影響

在不同pH值的緩沖溶液中進行漆酶降解磺胺類抗生素的實驗,比較反應(yīng)后體系中磺胺類抗生素的去除率.以SA作為反應(yīng)介體時,在pH=6的緩沖溶液中漆酶對磺胺類抗生素的降解去除率最高,5種抗生素的平均去除率均達到95%左右(圖5a).以HBT作為反應(yīng)介體時,在pH=5的緩沖溶液中漆酶對磺胺類抗生素的降解去除率相對最高,5種磺胺類抗生素的去除率為20%~ 60%(圖5b).pH值主要影響漆酶的催化活性,真菌漆酶的最適pH值為酸性[16].本研究中,由于磺胺類抗生素的磺酰胺基(-SO2NH-)可解離出氫離子,使其具有一定的酸性(pH值約為5.2),加入到pH=6和pH=5的緩沖溶液中,反應(yīng)體系最終的pH值均為5~6.這與文獻[18]中利用游離漆酶在pH=5的體系中降解2種磺胺類抗生素的結(jié)論基本一致.

2.5 反應(yīng)溫度的影響

如圖6所示,在漆酶+SA的反應(yīng)體系中,隨著反應(yīng)溫度的升高,磺胺類抗生素的降解率有下降的趨勢,下降幅度在10%~20%.在漆酶+HBT的反應(yīng)體系中,50℃時抗生素的降解率相對最大,30℃時降解率最小.總體而言,溫度對兩種反應(yīng)體系去除率的影響均不大.

在各種反應(yīng)條件下,磺胺甲惡唑(SMX)是5種磺胺類抗生素中去除率相對最低的一種,這可能與其氧化還原電位較高(1.098V)有關(guān),即氧化還原電位越低越能被漆酶氧化[18-19].同時,這也說明磺胺甲惡唑在環(huán)境中相對較穩(wěn)定,因此其潛在的環(huán)境風險值得關(guān)注.

2.6 漆酶起始濃度的影響

以SA作為反應(yīng)介體時,不同起始濃度(0~ 2mg/mL)漆酶對磺胺類抗生素的降解去除效果差異性不大,除磺胺甲惡唑外,其他幾類磺胺類抗生素的去除率均在75%~90%之間,平均去除率達到80%左右(圖7a).由此可見,在實驗反應(yīng)濃度范圍內(nèi),漆酶的濃度增加對磺胺類抗生素的降解沒有明顯的促進作用.而漆酶+HBT反應(yīng)體系中,隨著漆酶濃度的增大,5種磺胺類抗生素的去除率顯示出基本一致增大的趨勢(圖7b).然而,在最大的漆酶起始濃度2mg/mL下,體系對抗生素的去除率最大只有50%~70%左右.推測兩種介體反應(yīng)體系中,介體SA的介導作用較強,從而降低了對漆酶濃度的要求;而HBT的介導作用相對較弱,這時漆酶的濃度對促進降解反應(yīng)具有顯著影響.

2.7 最優(yōu)條件下磺胺類抗生素的降解去除效果

通過以上各參數(shù)優(yōu)化,在最優(yōu)條件下進行了漆酶+SA體系對5種磺胺類的降解實驗.結(jié)果如圖8所示,5種磺胺類抗生素的降解率在15min時達到75%左右,到1h時就達到97%以上,基本已經(jīng)降解穩(wěn)定.由抗生素對照組的降解去除率可以看出,5種抗生素中僅有磺胺吡啶不夠穩(wěn)定,3h后其自身降解率達到24%左右,其他4種抗生素自身降解率在10%以內(nèi).

本研究表明,漆酶在SA介體作用下能夠同時顯著降解5種磺胺類抗生素,在最優(yōu)條件下降解率達到97%以上.這與文獻[15]漆酶和介體反應(yīng)體系能夠?qū)前范奏奏ず突前烽g甲氧嘧啶降解的結(jié)論一致,該研究表明,脫苯胺和與介體的氧化耦合作用是磺胺類轉(zhuǎn)化的主要途徑.

3 結(jié)論

3.1 僅漆酶對磺胺類抗生素的降解作用非常有限.在介體作用下漆酶對磺胺類抗生素的降解作用則顯著提升.對比兩種典型的介體物質(zhì)SA和HBT,發(fā)現(xiàn)SA對促進漆酶降解磺胺類抗生素的效果更好,各抗生素的去除率平均提升了40%~ 60%.

3.2 介體SA對磺胺類抗生素的降解作用在0~2mmol/L內(nèi)隨著起始濃度的增加而增大,但隨著SA起始濃度的提升,體系對磺胺類抗生素的降解去除作用提升幅度較小,本研究確定0.5mmol/L為SA的最佳起始濃度.

3.3 在漆酶+SA反應(yīng)體系中,體系pH值為5~6,反應(yīng)溫度為30℃,漆酶起始濃度為0.5mg/mL,SA的起始濃度為0.5mmol/L時,5種磺胺類抗生素的降解去除率在15min時達到75%左右,1h內(nèi)達到97%以上.

3.4 適當?shù)慕轶w物質(zhì)可大大提升漆酶對磺胺類抗生素的降解效果.漆酶在介體物質(zhì)的作用下對抗生素類污染物的生態(tài)凈化具有良好的應(yīng)用潛力.本文對其降解機理的闡釋還不夠深入,磺胺類抗生素的降解產(chǎn)物及降解動力學亦有待進一步研究.

[1] 章 強,辛 琦,朱靜敏,等.中國主要水域抗生素污染現(xiàn)狀及其生態(tài)環(huán)境效應(yīng)研究進展 [J]. 環(huán)境化學, 2014,7:1075-1083.

[R]. WHO, 30APRIL, 2014.

[3] Sara R. Antibiotic resistance sweeping developing world [J]. Nature, 2014,509:141-142.

[4] Homem V, Santos L. Degradation and removal methods of antibiotics from aqueous matrices-A review [J]. Journal of Environmental Management, 2011,92:2304-2347.

[5] 李 陽,蔣國翔,牛軍峰,等.漆酶催化氧化水中有機污染物 [J]. 化學進展, 2009,10:2028-2036.

[6] Christoph A G, Erik M A, Patrick SLaccases to take on the challenge of emerging organic contaminants in wastewater [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014,98:9931–9952.

[7] 彭子原,袁興中,彭 馨,等.生物表面活性劑逆膠束中漆酶催化性能的研究 [J]. 中國環(huán)境科學, 2013,33(6):1091-1096.

[8] Shi L, Ma F, Han YRemoval of sulfonamide antibiotics by oriented immobilized laccase on Fe3O4nanoparticles with natural mediators [J]. Journal of Hazardous Materials, 2014,279:203– 211.

[9] Tomoyo S, Takayuki H, Shingo KTreatment of tetracycline antibiotics by laccase in the presence of 1-hydroxybenzotriazole [J]. Bioresource Technology, 2012,103:498–501.

[10] Migliore L, Fiori M, Spadoni A, et al. Biodegradation of oxytetracycline by Pleurotus ostreatus mycelium: a mycoremediation technique [J]. Journal of Hazardous Materials, 2012,215–216:227–232.

[11] Garcia H A, Hoffman C M, Kinney K A. Laccase-catalyzed oxidation of oxybenzone in municipal wastewater primary ef?uentWater research, 45(2011):1921-1932.

[12] W S, Ku K, Lai H. The implication of mediators for enhancement of laccase oxidation of sulfonamide antibiotics [J]. Bioresource Technology, 113(2012):259–264.

[13] Nguyen L N, Hai F I, Price W E, et al. The effects of mediator and granular activated carbon addition on degradation of trace organic contaminants by an enzymatic membrane reactor [J]. Bioresource Technology, 2014,167:169–177.

[14] Canas A I, Camarero S. Laccases and their natural mediators: biotechnological tools for sustainable eco-friendly processes [J].2010,28:694-705.

. Bioresource Technology, 2012,113:259–264.

[16] 靳 蓉,張飛龍.漆酶的結(jié)構(gòu)與催化反應(yīng)機理 [J]. 中國生漆, 2012,4:6-16.

[17] 張飛龍.中國髹漆工藝與漆器保護 [M]. 北京:科學出版社, 2010.

R, Mohammad A F, Mahvi A H, et al. Elimination and detoxification of sulfathiazole and sulfamethoxazole assisted by laccase immobilized on porous silica beads [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2015,97:107-114.

[19] Xu F, Kulys J J, Duke K, et al. Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-hydroxy compounds [J]., 2000,5:2052–2056.

* 責任作者, 教授, zhangwh@whu.edu.cn

Role of two mediators in sulfonamide antibiotics degradation by laccase oxidation system

DING Hui-jun1,2,3, WU Yi-xiao1, ZHONG Jia-you2,3, ZOU Bin-chun2,3, ZHANG Wei-hao1*, LOU Qian2,3

(1.School of Resource and Environmental Science, Wuhan University, Wuhan 430079, China；2.Jiangxi Provincial Institute of Water Sciences, Nanchang 330029, China；3.Jiangxi Provincial Key Laboratory of Water Resources and Environment of Poyang Lake, Nanchang 330029, China)., 2016,36(5)：1469~1475

Two kinds of mediators, namely syringaldehyde (SA) and1-hydroxybenzotriazole (HBT), were investigated in laccase oxidation system, regarding the degradation of five kinds of typical sulfonamide antibiotics. The influences of factors, such as the initial concentrations of mediators, pH, temperature and the concentration of laccase, were studied. The results showed that SA was more effective in mediating laccase oxidation of all five kinds of sulfonamide antibiotics. In laccase+SA reaction system, the optimum conditions for the degrading the sulfonamide antibiotics by laccase were: at pH5~6 and 30℃, and with initial concentrations of SA and laccase respectively 0.5mmol/L and 0.5mg/mL. The degradation rates reached around 75% in 15minutes and more than 97% within 1hour for all five kinds of sulfonamide antibiotics. This study showed that the appropriate mediator can greatly improve laccase oxidation. Laccase oxidation assisted by mediators has a good application potential for the ecological purification of antibiotic pollutants.

syringaldehyde (SA)；1-hydroxybenzotriazole (HBT)；laccase；sulfonamide antibiotics；degradation

X171,X131

A

1000-6923(2016)05-1469-07

丁惠君(1983-),女,江西豐城人,武漢大學博士研究生,高級工程師,主要從事環(huán)境新型污染物生態(tài)效應(yīng)及生物轉(zhuǎn)化.發(fā)表論文14篇.

2015-09-28

江西省水利廳重大科技項目(KT201412);水利部鄱陽湖水資源水生態(tài)環(huán)境研究中心基金項目(kfjj201403);國家重點基金項目(41331174);湖北省環(huán)境保護廳環(huán)?？蒲许椖?2014HB08).