張平，馬惠琴，龍冬梅，賀志昊，王蕓華，楊廷軍（貴州省畢節(jié)市動物疫病預防控制中心，貴州畢節(jié)551700）

豬藍耳病毒感染的實驗室診斷

張平，馬惠琴，龍冬梅，賀志昊，王蕓華，楊廷軍
（貴州省畢節(jié)市動物疫病預防控制中心，貴州畢節(jié)551700）

2015年8月,畢節(jié)市某豬場發(fā)生一起以發(fā)病豬體溫升高、母豬流產(chǎn)、仔豬高死亡率為特點的傳染病。當?shù)孬F醫(yī)根據(jù)臨床癥狀指導用了大量的藥物治療，但效果不佳。通過流行病學調查、臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍耳病,為確診病原,對病死豬的組織進行了實驗室檢測。通過R T-PCR試驗檢測，確診為高致病性豬藍耳病毒陽性。

豬藍耳病病毒；實驗室檢測；實時熒光R T-PCR

高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）變異毒株引起的一種急性、高傳染性、高致病性的疫病，目前已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。豬藍耳病病毒于2005年發(fā)生變異后引起高致病性豬藍耳病，發(fā)病率、致死率均顯著增高。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告疫病，我國列為二類動物疫病。由于最先在歐洲的臨床病例出現(xiàn)特有的豬的耳朵藍灰色病變，我國學者、飼養(yǎng)人員和臨床獸醫(yī)將其簡稱為豬藍耳病或藍耳病[1-5]。該病有美洲株和歐洲株兩大類型，美洲株最早在美國發(fā)現(xiàn)，20世紀90年代后傳入我國。2015年8月,畢節(jié)市某豬場發(fā)生一起以發(fā)病豬體溫升高、母豬流產(chǎn)、仔豬高死亡率為特點的傳染病。當?shù)孬F醫(yī)根據(jù)臨床癥狀指導用了大量的藥物治療，但效果不佳。通過臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍耳病,綜合流行病學信息、臨床表現(xiàn)及剖檢病變懷疑為豬藍耳病病毒或豬瘟病毒感染，也可能為二者混合感染，為對該病例作出確切性診斷，特進行實驗室檢測。對畢節(jié)某規(guī)模豬場出現(xiàn)的妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及部分仔豬發(fā)病的情況,為確診病原，本文利用實驗室實時熒光RT-PCR診斷技術，最終確診為豬偽狂犬病毒感染引起。

一、材料與方法

（一）材料

1.病料。采集病死豬只組織（脾臟、淋巴結）放在雙抗PBS溶液中，低溫冷藏保存運至畢節(jié)市動物疫病預防控制中心獸醫(yī)實驗室。

2.主要試劑。世紀元亨豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NSP2 1594-1680變異株)檢測試劑盒，豬藍耳病病毒熒光定量PCR試劑盒。

（二）方法

1.樣品的處理。取病死豬只組織（脾臟、淋巴結），用手術剪剪碎混勻后取0.5g于組織勻漿機中研磨，加入2mL去離子水，研磨均勻后離心取500μL上清液于滅菌離心管中。

2.RNA提取。按照豬藍耳病病毒提取試劑盒說明書進行。

3.實時熒光RP-PCR檢測。反應采用25μL體系，反應體系為：無菌無核酸水2.7μL，RT-PCR反應液10μL，酶混合液0.4μL，熒光探針1.9μL，RNA模板10μL。反應條件為：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每個循環(huán)第二步收集FAM熒光信號，共40循環(huán)（報告基因“FAM”，淬滅基團“NONE”）

二、試驗結果

（一）臨床癥狀及藥物治療情況

采樣時共有13頭左右發(fā)病，死亡3頭。主要臨床癥狀為:食欲不振、流產(chǎn)、嘔吐、病程短的6～12h死亡，病程長的死亡前四肢劃動，有神經(jīng)癥狀。發(fā)病母豬有流產(chǎn)死胎現(xiàn)象腹部發(fā)紅。剖檢主要表現(xiàn)為:肺臟肉變，肝臟充血，腎臟表皮有點狀出血，腸系膜淋巴結嚴重腫大。交替使用青鏈霉素、頭孢類、磺胺類等藥物肌肉注射治療，使用多量維生素和干擾素混水飲用，但治療效果不佳。

（二）實驗室檢測結果

經(jīng)畢節(jié)市動物疫病預防控制中心采集該場病死豬樣品進行分子生物學檢測，結果顯示，病死豬只組織均檢出疑似高致

圖1　PRV實時熒光RT-PCR檢測結果A1：陽性對照；E1：陰性對照；B1/C1/D1：待檢樣品

三、討論

豬群一旦發(fā)生高致病性豬藍耳病后極易混合感染或繼發(fā)豬瘟、圓環(huán)病毒、細菌性疾病等，特別是豬瘟，可以說是豬病的萬惡之源，所以必須搞好豬瘟的預防和凈化工作[6-9]。其他疾病能使用疫苗免疫預防的，按免疫程序按時開展，如果沒有疫苗免疫預防的，可提前采用一些藥物進行預防[10]。高致病性豬藍耳病臨床上多表現(xiàn)為母豬的流產(chǎn)和仔豬的腹瀉、神經(jīng)癥狀，僅從臨床表現(xiàn)和剖檢很難將其與有相似癥狀的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等區(qū)分開來，需要進行實驗室檢測才能確診。本文采用分子生物學技術對流產(chǎn)胎兒組織進行實時熒光RT-PCR方法的檢測，確診了該次疫病由豬偽狂犬病毒引起。為今后實驗室確診豬偽狂犬病提供基礎科學依據(jù)。

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（編輯：張瓊瓊）

S858.28

B

1673-9019(2016)13-0034-02

2016-06-06

張平（1988-），女，安徽阜陽人，主要從事獸醫(yī)實驗室檢測工作。病性豬藍耳病病毒核酸陽性，沒有檢出豬瘟、圓環(huán)病。（見圖1）。由圖可知病死豬組織樣品DNA均呈出現(xiàn)特異性擴增曲線。