聶紅云,聶麥茜,白雪蕊,趙 璇,宋勃軒

?

克雷伯氏菌NY1產絮凝劑的陽離子修飾研究

聶紅云,聶麥茜*,白雪蕊,趙 璇,

(西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院,陜西 西安 710055)

為簡化微生物絮凝劑投加步驟,消除由于助凝劑添加而引起的環(huán)境二次污染問題,以3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(CTA)修飾荷負電的微生物絮凝劑(~-54mV),從而獲得荷正電的改性絮凝劑.實驗結果顯示,CTA與NaOH的摩爾比值是影響陽離子修飾效果的主要因素;陽離子修飾的的最佳條件為:10g微生物絮凝劑, 0.015mol CTA,20%含水率,CTA與NaOH的摩爾比為0.95,80℃反應2h后.在最佳條件下所得陽離子化微生物絮凝劑的Zeta電位可達+16mV,其對高嶺土的絮凝率也由陽離子化前的60.5%上升至91%.由陽離子化絮凝劑的結構表征可知,陽離子修飾過程并未改變微生物絮凝劑的根本結構,只是在原微生物絮凝劑基礎上引入陽離子基團,從而增加了絮凝劑整體分子量;同時,由于陽離子基團的大量引入,絮凝劑的結晶度增加,從而使其溶解度增加.將陽離子化前后微生物絮凝劑應用于去除銅綠微囊藻,當陽離子化后微生物絮凝劑添加量為40mg/L時,其對藻類的去除率超過98%;而未陽離子修飾的微生物絮凝劑對該藻幾乎沒有去除效果.

3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(CTA)；微生物絮凝劑；陽離子修飾

微生物絮凝劑是一類由微生物產生的具有絮凝活性的代謝產物[1-3].因其高效、無毒、無二次污染以及用途廣泛等優(yōu)勢而成為研究熱點.微生物直接分泌的具有絮凝活性的物質均荷負電,需Ca2+、Mg2+等陽離子或聚合氯化鋁等作助凝劑,以提高其水處理的效率和活性[4-7].這將導致沉降污泥和處理后水樣中殘留較高Ca2+、Mg2+或Al3+,易引起二次污染,且應用時須與助凝劑分別投加,致使操作步驟繁瑣.微生物絮凝劑陽離子化修飾是解決該問題的途徑之一.目前,生物大分子陽離子化研究主要集中在淀粉[8-9]、纖維素[10-12]、殼聚糖等多糖類天然產物.糖蛋白或蛋白類因分子中官能團和空間結構復雜,易變性,目前尚未見糖蛋白絮凝劑陽離子化的相關報道.本文以陽離子醚化劑修飾糖蛋白類微生物絮凝劑,使修飾后的絮凝劑分子荷正電,旨在提高其活性及其實用性,為微生物絮凝劑工業(yè)化提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:克雷伯氏菌NY1為課題組前期從污水處理廠污泥中分離篩選而得[13].

種子液培養(yǎng)基:3g牛肉膏,10g蛋白胨和5g NaCl,溶于800mL蒸餾水,pH值調至7.5,并用蒸餾水定容至1000mL,滅菌備用.

發(fā)酵培養(yǎng)基:20g蔗糖, 2.12g NaNO3,0.4mL 1mol/L MgSO4溶液,0.1mL 1mol/L CaCl2溶液,磷酸鹽緩沖溶液25mL,1mL微量元素溶液,并用蒸餾水定容至1000mL,滅菌備用.

1.2 方法

1.2.1 克雷伯氏菌NY1發(fā)酵產絮凝劑 無菌條件下,從NY1菌保存平板上挑取單克隆于100mL滅菌的種子液培養(yǎng)基中.將該體系于31℃, 150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)16h得種子液.在無菌工作臺中,將該種子液按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中.于31℃,150r/min恒溫發(fā)酵72h.

1.2.2 微生物絮凝劑的提取及純化 將克雷伯氏菌NY1 72h后的發(fā)酵液于4℃,8000r/min離心15min,棄菌體,上清液按照體積比為1:3與無水乙醇混合,搖勻后靜置.離心,傾去上清液,即得微生物絮凝劑粗品[14].

將絮凝劑粗品溶于少量蒸餾水,再次用無水乙醇沉淀,反復3次,即得絮凝劑純品.

1.2.3 微生物絮凝劑的陽離子修飾 陽離子修飾微生物絮凝劑的反應采取L16(45)正交試驗進行優(yōu)化,各因素水平見表1,具體實驗安排見表2.反應過程如下:將3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(CTA)與NaOH水溶液按一定比例進行混合,攪拌使其反應10min.然后加入10g NY1菌所產絮凝劑純品,于室溫下攪拌1h,放入恒溫箱中反應數(shù)小時.反應完畢后,于反應體系中加入少量蒸餾水使其完全溶解,按1:3比例加入無水乙醇反復萃取3次,8000r/min離心,將所得固體于60℃下干燥,即得陽離子修飾后的微生物絮凝劑.

表1 陽離子化反應正交L16(45)因素水平Table1 Factors and levels of Orthogonal L16 (45) for cationization

注: A、B、C、D、E分別為:陽離子醚化劑用量、陽離子醚化劑與NaOH用量摩爾比值、反應時間、反應溫度以及含水率.

1.2.4 絮凝活性的測定 將0.4mL陽離子修飾微生物絮凝劑(1g/L)加至50mL 2g/L的高嶺土懸濁液(pH=7.5)中,或將0.2mL未陽離子修飾微生物絮凝劑(2g/L)和0.2mL的濃度為1mol/L CaCl2溶液依次加入50mL 2g/L的高嶺土懸濁液(pH=7.5)中,快速攪拌1min,慢速攪拌2min,然后靜置5min,測定上清液吸光度OD550nm.絮凝率計算公式為:

絮凝率(%) = [(-) /]′100% (1)

式中:為絮凝劑加入前高嶺土懸濁液在550nm處的吸光度;為混凝后上清液在550nm處的吸光度.

1.2.5 陽離子修飾后絮凝劑的結構表征 絮凝劑Zeta電位測定:將純化后的絮凝劑配制成50mg/L的溶液,多次測量其電位,然后取平均值.

絮凝劑粒徑分布測定:取1mL 5g/L純化后的絮凝劑水溶液,用激光粒度分布測定儀對絮凝劑溶液粒徑分布進行測定.

紅外光譜分析:取約20mg絮凝劑樣品,與KBr混勻壓片后,使用傅里葉紅外光譜分析儀測定紅外光譜.

掃描電鏡:將純化后的陽離子修飾絮凝劑研磨成粉末,置于樣品柱上噴金(Bal-Tec SCD005Sputter Coater),然后在JSM 6510LV 掃描電鏡上進行表面掃描.

1.2.6 陽離子化微生物絮凝劑對高藻水中藻類的絮凝去除 將一定量的陽離子修飾微生物絮凝劑(1g/L)加至高藻水中,或將0.2mL未陽離子修飾微生物絮凝劑(2g/L)和0.2mL的濃度為1mol/L CaCl2溶液依次加至高藻水中,快速攪拌1min,慢速攪拌2min,然后靜置5min,于液面下3cm 處取樣.以藻類分析儀測定絮凝前后藻類濃度,計算絮凝率.絮凝率計算公式為:

絮凝率(%) = [(1-2)/1]′100% (2)

式中:1為絮凝劑加入前藻類濃度;2為絮凝劑加入后藻類濃度.

2 結果與討論

2.1 陽離子化正交實驗結果

由表3可知,各因素的極差排列順序為RB> RA>RC>RE>RD,由此可知,各反應因素對陽離子修飾效果的影響大小順序為:“陽離子醚化劑/NaOH”摩爾比>陽離子醚化劑用量>反應時間>含水率>反應溫度,最佳反應條件組合為A1B4C4D4E4.因此,對于10g微生物絮凝劑,當CTA為0.015mol,CTA與NaOH的摩爾比為0.95,含水率為20 %時,于80 ℃反應時間2h后,所得陽離子化微生物絮凝劑對SS的去除率最佳,其單獨使用時,對含2g/L高嶺土水中的SS去除率可達91 %.

表3 陽離子化反應正交L16(45)實驗數(shù)據結果Table 3 Data analysis of cationization obtained by orthogonal L16 (45)

注:a表示反應未進行.

2.2 陽離子化對絮凝劑Zeta電位及活性的影響

如圖1所示,陽離子修飾大大改變了微生物絮凝劑Zeta電位及其絮凝活性.微生物絮凝劑的平均Zeta電位為-50.2mV,在添加助凝劑條件下,其對2g/L的高嶺土懸濁液的最佳絮凝效率為60.5%;陽離子后,改性絮凝劑Zeta電位提高至+16.5mV,在無助凝劑且投加量相同的條件下,其對高嶺土懸濁液的絮凝效率上升至91 %.該結果說明,上述正交試驗已成功將微生物絮凝劑陽離子化,使其荷正電.

2.3 陽離子化對NY1菌所產糖蛋白絮凝劑分子結構的影響

圖2中3650~3000cm-1寬而強的譜帶是締合的—NH/—OH伸縮振動吸收峰,~2920cm-1處弱的吸收帶為C—H不對稱伸縮振動吸收峰,1640, 1535,1400cm-1吸收峰為蛋白質中酰胺基的Ⅰ譜帶 (C—O伸縮振動)、酰胺Ⅱ譜帶(N—H彎曲與C—N伸縮振動疊加)和酰胺Ⅲ譜帶(C—N伸縮振動),結合前期絮凝劑組成測定結果[15]可知,陽離子化前后,微生物絮凝劑分子中糖蛋白的主要官能團并未發(fā)生大的變化.然而,陽離子化后絮凝劑紅外譜圖中,~1480cm-1處的吸收峰明顯增強,400~900cm-1處的吸收譜帶變寬,該兩處吸收峰為陽離子醚化劑的特征吸收峰.因此,紅外光譜結果進一步證明陽離子修飾反應成功將陽離子醚化劑引入微生物絮凝劑中.

2.4 陽離子化對NY1菌所產糖蛋白絮凝劑粒徑分布的影響

由圖3可知,陽離子化前后,絮凝劑粒徑分布變化較大.粒徑在1.26~111μm 和133.7~339.9μm范圍內的絮凝劑,陽離子化前,分別占絮凝劑總體積的72.9%和24%;陽離子化后,分別占絮凝劑總體積的61.7%和33.3%.因此,陽離子化后,絮凝劑的粒徑分布向大粒徑方向移動.這也說明陽離子修飾過程并未從破壞原有微生物絮凝劑的整體結構,只是在原有微生物絮凝劑的基礎上引入陽離子基團.

2.5 陽離子化對NY1菌所產糖蛋白絮凝劑表面形貌的影響

由圖4看,陽離子修飾前后絮凝劑表面形態(tài)有較大的變化.陽離子修飾之前,絮凝劑為不規(guī)則、無定型狀結構,說明克雷伯氏菌NY1所產絮凝劑為無定型的大分子,與前期研究結果一致[15].陽離子修飾之后,絮凝劑呈八面體結晶狀,這與分子中引入大量陽離子基團有關.陽離子修飾后,絮凝劑整體的離子強度增加,結晶度增加,從而使其溶解度大大提高.陽離子修飾前,干燥的微生物絮凝劑溶解緩慢,較難溶,一般需要浸泡過夜才能完全溶解,有時甚至需要加熱;而陽離子修飾后,絮凝劑加水即溶,更易以溶液形式投加,從而方便了絮凝劑的應用.

2.6 陽離子化對NY1菌所產糖蛋白絮凝劑去除銅綠微囊藻的影響

由圖5結果看,陽離子化前的微生物絮凝劑對銅綠微囊藻幾乎沒有去除效果,其最大去除率為10%;而陽離子化后的微生物絮凝劑對銅綠微囊藻的去除率隨其添加量的增加而增加,在其終濃度為40mg/L時,對藻類的去除率超過98%.

3 結論

3.1 根據正交實驗極差結果可知,各反應因素影響大小的排序為:陽離子醚化劑與NaOH用量摩爾比值>陽離子醚化劑用量>反應時間>含水率>反應溫度,其中陽離子醚化劑與NaOH用量摩爾比值為主要影響因素.

3.2 微生物絮凝劑陽離子化最優(yōu)條件為:每10g絮凝劑中需加入陽離子醚化劑0.015mol,陽離子醚化劑與NaOH用量摩爾比值為0.95,反應時間2h,反應溫度80℃,含水率20%,單獨添加在該條件下合成的新型絮凝劑,其對2g/L的高嶺土的去除率可達91%.

3.3 陽離子修飾后,微生物絮凝劑的Zeta電位大幅度增加,從荷負電提升為荷正電,絮凝活性亦提高.陽離子修飾并未改變微生物絮凝劑根本架構,只是在原微生物絮凝劑結構基礎上引入陽離子基團,從而增加了絮凝劑整體分子量,有利于混凝過程中絮體的快速沉降.大量陽離子基團引入,增加了絮凝劑的結晶度與溶解度,方便了絮凝劑的應用.

3.4 陽離子化前微生物絮凝劑對銅綠微囊藻幾乎沒有去除效果;而陽離子化后的微生物絮凝劑對該藻的去除率隨其添加量的增加而增加,在其終濃度為40mg/L時,對藻類的去除率超過98%.

[1] Uchechukwu U Nwodo, Ezekiel Green, Anthony I. OkohReview Bacterial Exopolysaccharides: Functionality and Prospects [J]. Int. J. Mol. Sci., 2012,13:14002-14015.

[2] Xiong Yuyan , Wang Yuanpeng , Yu Yi , et al. Production and characterization of a novel bioflocculant from Bacillus licheniformis [J]. Appl. Environ. Microbiol., 2010,76(9):2778– 2782.

[3] 張媛媛,楊朝暉,曾光明,等.微生物絮凝劑MBFGA1的結構鑒定及絮凝機理研究 [J]. 中國環(huán)境科學, 2013,33(2):278-285.

[4] 黃 兢,楊朝暉,孫珮石,等.微生物絮凝劑與聚合氯化鋁復配的響應面優(yōu)化 [J]. 中國環(huán)境科學, 2008,28(11):1014-1019.

[5] Zaki S, Farag G, Abu Elreesh M, et al. Characterization of bioflocculants produced by bacteria isolated from crude petroleum oil [J]. Int. J. Environ. Sci. Tech., 2011,8(4):831-840.

[6] 毛 進,聶麥茜,吳 燕,等.SS的研究 [J]. 水處理技術, 2008,34(5):11-14.

[7] Yang ZH, Huang J, Zeng GM, et al. Optimization of flocculation conditions for kaolin suspension using the composite flocculant of MBFGA1and PAC by response surface methodology [J]. Bioresour. Technol., 2009,101:1044-1048.

[8] 貢燕君,任 軼,金東青.淀粉接枝陽離子絮凝劑的制備及性能研究 [J]. 環(huán)境保護科學, 2009,35(2):46-51.

[9] Berzin F, Tara A, Vergnes B. Optimization and scale-up of starch cationization in a twin screw extruder [J]. Polym. Eng. Sci., 2007,47(6):814–823.

[10] 梁亞琴,胡志勇,曹端林.陽離子化羥乙基纖維素醚的合成與溶液性質 [J]. 日用化學工業(yè), 2006,36(4):213-215.

[11] Sanjit Acharya, Noureddine Abidi, Rajeev Rajbhandari, et al. Chemical cationization of cotton fabric for improved dye uptake [J]. Cellulose, 2014,21:4693–4706.

[12] Mohammad Shateri Khalil-Abad, Mohammad Esmail Yazdanshenas, Mohammad Reza Nateghi. Effect of cationization on adsorption of silver nanoparticles on cotton surfaces and its antibacterial activity [J]. Cellulose, 2009,16:1147–1157.

[13] Nie M, Yin X, Jia J, et al. Production of a novel bioflocculant MNXY1by Klebsiella pneumoniae strain NY1and application in precipitation of cyanobacteria and municipal wastewater treatment [J]. J. Appl. Microbiol., 2011,111(3):47-58.

[J]. American Institute of Biological Scicnce, Washingtonn D.C., 1971:87-98.

[15] 符海林,聶麥茜,郭育濤,等.Mg2+對克雷伯氏菌NIII2及其誘變菌產絮凝劑特性的影響 [J]. 環(huán)境工程學報, 2014,8(12):5514- 5520.

* 責任作者, 教授, niemaiqian@xauat.edu.cn

Cationization of microbioflocculants produced bysp. NY1

NIE Hong-yun, NIE Mai-qian*, BAI Xue-rui, ZHAO Xuan, SONG Bo-xuan

(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China)., 2016,36(6)：1788~1793

To simplify the dosing steps of microbioflocculants and eliminate the secondary pollution arising as the using of flocculation aid, 3-chloro-2-hydroxy-propyl-trimethyl ammonium chloride (CTA) was employed to modify the negatively charged microbioflocculants (~-54mV) so as to obtain the positively charged cationized flocculants in this paper. The results showed that the mole ratio of CTA/NaOH was the major influence factor for successful cationization of microbioflocculants. Optimal cationization conditions of microbioflocculants were:10g microbioflocculants, 0.015mol CTA, the mole ration of CTA/NaOH=0.95 and 20% (m/m reaction system) water, reacting at 80℃ for 2h. Under the optimal conditions, Zeta potential of the obtained cationized flocculants reached +16mV, flocculating activity of the obtained cationized flocculants increased from 60.5% which was the maximum flocculating activity of the unmodified microbioflocculants to 91%. Characterization results of the cationized flocculants showed that, the cationized group has indeed introduced into the original microbioflocculant during the cationization reactions, but did not change its carbon skeleton structure, so the ratio of the large molecular weight in the cationized flocculants is increased. And meanwhile the large amount of cationized group increased the crystalline and the solubility of the modified flocculants. The modified flocculants could also be applied for removing microcystis aeruginosa, and its removing rate could exceed 98% when the concentration of cationized microbioflocculants was 40mg/L, while the unmodified microbioflocculants have no effect on the removing of microcystis aeruginosa.

3-chloro-2-hydroxy-propyl-trimethyl ammounium chloride (CTA)；microbioflocculants；cationization

X703

A

1000-6923(2016)06-1788-06

聶紅云(1983-),女,陜西大荔人,西安建筑科技大學博士研究生,主要從事微生物降解及胞外分泌物的研究.發(fā)表論文6篇.

2015-12-05

國家自然科學基金資助項目(51278405);陜西省重點科技創(chuàng)新團隊建設計劃(2013KCT-13)