伍世表廣東省中醫(yī)院腦病科，廣東廣州　510006

氯化鋰對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值及GSK-3β蛋白表達(dá)影響的研究

伍世表
廣東省中醫(yī)院腦病科，廣東廣州510006

目的 探討GSK-3抑制劑（Licl）治療腦膠質(zhì)瘤的可行性及其機(jī)制。方法 于2015年1月—2015年6月期間將U251細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇處理后，經(jīng)DMEM培養(yǎng)液并在接種后24 h達(dá)到連續(xù)傳代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；分別將不同濃度的LiCl作用于U251細(xì)胞24、48 h；并對(duì)比不同濃度與不同作用時(shí)間下細(xì)胞的存活率、細(xì)胞周期改變情況以及GSK-3β蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 處理前，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的MTT值為1.0，不同濃度LiCl作用U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后，MTT值下降為0.45，與處理前比較結(jié)果顯示藥物組的MTT值顯著低于未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，并呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論 LiCl抑制劑能明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的增殖，而且能上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)。

氯化鋰；膠質(zhì)瘤；增值；蛋白表達(dá)

［Abstrct］Objective To investigate the feasibility of GSK-3 inhibitor（Licl）and its mechanism of treating brain glioma. Methods During the period from January 2015 to June 2015 will be U251 cell recovery after treatment by DMEM medium and at 24 h after inoculation to continuous passage of the logarithmic growth phase；then different concentration of LiCl in U251 cells and 24h，48h；comparison of cells at different concentrations and different action time on the survival rate，the changes of cell cycle and the expression of GSK-3 beta protein.Results Before treatment，U251 glioma cells MTT 1，different concentrations of LiCl in U251 glioma cells after 24 h，the MTT value decreased to 0.45，compared with the results before treatment showed drug group the MTT value was significantly lower than that in the untreated group，with statistical significance，P＜0.05，in a dose-dependent manner.Conclusion LiCl inhibitors can significantly inhibit the proliferation of U251 glioma cell lines，and can adjust the GSK-3 beta Protein expression.

［Key words］Lithium chloride；Glioma；Proliferation；Expression

膠質(zhì)瘤是較為常見的原發(fā)性神經(jīng)上皮腫瘤，其具有復(fù)發(fā)率高、致殘率高、病死率高的特點(diǎn)，治療難度非常大量，是繼腦卒中后人類健康的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。該組所有研究均于2015年1月—2015年6月期間完成，以膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（U251）作為研究樣本，分別將不同濃度的LiCl作用于U251細(xì)胞24、48 h；并對(duì)比不同濃度與不同作用時(shí)間下細(xì)胞的存活率、細(xì)胞周期改變情況以及GSK-3β蛋白的表達(dá)情況，以分析GSK3在膠質(zhì)瘤治療中的分子機(jī)制與可行性，并為今后的工作提供參考，現(xiàn)報(bào)道下。

1　資料與方法

1.1一般資料

該組所有研究均于2015年1月—2015年6月期間完成，采購(gòu)U251細(xì)胞（上海細(xì)胞庫(kù)），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó) Gibco公司，Lithium chloride購(gòu)于Sigma公司，GSK-3β兔抗人單克隆抗體購(gòu)于CST公司，MTT購(gòu)于AMRESCO公司，RNase A、碘化丙碇（Pl）購(gòu)于BIOSHARP公司。

1.2方法

1.2.1噻唑藍(lán)比色分析法 （MTT實(shí)驗(yàn)）用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液將U251細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）制成懸浮細(xì)胞，并在無(wú)菌96孔板培養(yǎng)24 h后，分別加入200 uLmL的LiCL藥物0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM，培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20 uL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸走上清液，每孔加入150 uL的DMSO，避光振蕩溶解10 min，檢測(cè)波長(zhǎng)490 mm時(shí)各孔的吸光值（OD）［2］。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期以0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM LiCl藥物作用U251細(xì)胞24 h后，將U251細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)達(dá)到4×106個(gè)/mL，離心（1 000 r/min，5 min）棄去培養(yǎng)液；PBS洗2次，離心（1 000 r/min，5 min）棄去PBS，加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇，置于-20℃固定過(guò)夜。離心（1 000 r/min，5 min）棄去固定液 ，PBS重懸2次×5min，離心（1 000 r/min，5 min）后棄去 PBS；采用PI染色液，室溫避光染色5 min后上樣，樣品計(jì)數(shù)達(dá)2.0×104個(gè)細(xì)胞 ，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)相所占的百分比。

1.2.3細(xì)胞免疫化學(xué) 用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液將U251細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）制成懸浮細(xì)胞，并接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2 h后，每孔加1 mL培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，分別加入1 mL的LiCL藥物0、0.5、2.0、8.0、10、30 mM，培養(yǎng)至48 h時(shí)，吸走培養(yǎng)液，漂洗3次，加入500 uL 4%多聚甲醛，冰箱中冷藏20 min（4℃）；吸走4%多聚甲醛，并用PBS溶液洗5次，3 min/次。再按照SP免疫組化試劑盒進(jìn)行操作，最后顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)［3］。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用EpiData軟件進(jìn)行雙錄入，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

結(jié)果顯示藥物組的MTT值顯著低于未處理組，處理前，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的MTT值為1.0，不同濃度LiCl作用U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞24h后，MTT值下降為0.45，與處理前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，并呈劑量依賴關(guān)系（圖1）。

圖1　MTT比色法示各濃度細(xì)胞的吸光度值（P＜0.05）

3　討論

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是真核生物中普遍存在的多功能絲氨酸/蘇氨酸類激酶［4］。關(guān)于GSK-3最早的研究是將其作為糖代謝的主要限速酶，參與糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成的研究之中。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入目前已經(jīng)至少發(fā)現(xiàn)三條腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與GSK-3密切相關(guān)，而且已經(jīng)有研究證實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)GSK-3活性能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或凋亡［5］。

該組研究中，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞在不同濃度LiCl作用后，其增殖被明顯抑制，并且抑制的程度與LiCl的濃度成正相關(guān)；而且U251細(xì)胞的細(xì)胞增殖期明顯減少，GSK-3β蛋白表達(dá)明顯增加，且增加的程度與LiCl的濃度成正相關(guān)；其細(xì)胞核增加的程度最為明顯，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明LiCl抑制劑能明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的增殖，而且能上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)。證明LiCl抑制劑治療膠質(zhì)瘤具有可行性，能為下一步的機(jī)制研究提供初步的分子基礎(chǔ)。關(guān)于GSK-3對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的機(jī)制尚無(wú)明確結(jié)論，有研究表明［5］GSK-3通過(guò)激活β-catenin相關(guān)基因，抑制了腫瘤細(xì)胞活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。大量國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)［6］，LiCl是GSK-3的選擇性抑制劑，經(jīng)LiCl處理后GSK-3的磷酸化會(huì)明顯增加，該文中利用LiCl抑制U251增殖與活性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［7］，主要是導(dǎo)致GSK-3β無(wú)法磷酸化細(xì)胞內(nèi)的β-catenin，使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚集并移向胞核和T細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子相結(jié)合，激活下游基因，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖；下降或上調(diào)GSK-3β的活性可以影響腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)［8］。

綜上所述，LiCl抑制劑能明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的增殖，而且能上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)，但是關(guān)于其對(duì)膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用尚無(wú)明確依據(jù)，需要在今后的工作中通過(guò)大量臨床研究以證實(shí)。

［1］梁林輝，王英成，韋錦學(xué).利培酮在U251細(xì)胞中調(diào)節(jié)PI3K-Akt-GSK3β信號(hào)通路的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2014，44（13）：11608-1162.

［2］L Liu，Z Dong，J Liang.As an independent prognostic factor，F(xiàn)AT10 promotes hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma progression via Akt/GSK3β pathway［J］.Oncogene 2014，13（7）：419-422.

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［6］楊志英，鄧志剛，伍健明，芹菜素對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及 p21、p53蛋白表達(dá)的影響 ［J］.中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2013，13（37）：551-556.

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Study of Proliferation and Protein Expression of GSK3β by Lithium Chloride in Human Glioma Cell Line U251

WU Shi-biao
Department of encephalopathy，Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou，Guangdong Province，510006 China

R739

A

1674-0742（2016）07（b）－0028-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.20.028

伍世表（1982.7-），男，廣東茂名人，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：腦膠質(zhì)瘤。

（2016-04-16）