韋艷梅，周雅琴，李　力，譚小明

( 西南瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，廣西藥用植物園，南寧 530023 )

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白及內(nèi)生真菌多樣性研究

韋艷梅，周雅琴，李力，譚小明*

( 西南瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，廣西藥用植物園，南寧 530023 )

白及(Bletillastriata)是蘭科地生型多年生植物，也是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一。利用菌根技術(shù)進(jìn)行白及的保護(hù)和人工栽培，需要獲得白及可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌。該研究以廣西野生的白及根和葉為材料，采用分離培養(yǎng)法分離內(nèi)生真菌，并結(jié)合真菌形態(tài)特征，及其核糖體的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析，確定內(nèi)生真菌的分類地位。結(jié)果表明：從2株白及植物90塊組織中分離獲得37株內(nèi)生真菌，鑒定為15個(gè)分類單元，由9個(gè)屬組成，分屬于2門(mén)4綱7目8科，包括錘舌菌綱(Leotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和糞殼菌綱(Sordariomycetes)，傘菌綱(Agaricomycetes)。從根中分離獲得內(nèi)生真菌12種，蠟殼菌屬為優(yōu)勢(shì)屬；從葉中分離獲得內(nèi)生真菌3種，刺盤(pán)孢屬為優(yōu)勢(shì)屬；刺盤(pán)孢菌屬(Colletotrichum)和蠟殼菌屬(Sebacina)真菌的相對(duì)多度值均達(dá)到20%；4株擔(dān)子菌均分布于根中，葉組織中未有分布。根組織中內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)(H=1.863)高于葉組織(1.098)。該研究結(jié)果及其所分離培養(yǎng)的擔(dān)子菌類真菌，為更好地利用菌根技術(shù)進(jìn)行白及等蘭科植物資源的保護(hù)與可持續(xù)利用奠定了基礎(chǔ)。

白及，可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，蠟殼菌屬，多樣性, 鑒定

白及(Bletillastriata)為蘭科(Orchidaceae)白及屬(BletillaReichb. f.)地生型多年生植物，其花色艷麗，極具觀賞價(jià)值，還是目前我國(guó)瀕危緊缺的中藥材之一，其根莖中富含藥用成分白及膠質(zhì)，具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌等作用(國(guó)家藥典委員會(huì)，2015)，療效確切，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。但是，由于白及種子無(wú)胚乳，自然條件下難以萌發(fā)，僅靠無(wú)性繁殖，繁殖系數(shù)極低；加之近年來(lái)野生白及棲息地環(huán)境惡化和多年來(lái)的亂采亂挖，導(dǎo)致野生白及資源幾近枯竭，市場(chǎng)供不應(yīng)求，嚴(yán)重限制了其在醫(yī)藥、食品、化狀品及其他方面的應(yīng)用(劉光斌等, 2005)。因此，如何實(shí)現(xiàn)白及資源的保護(hù)與資源再生，是一個(gè)重要而急切的課題。

研究表明，所有蘭科植物均與內(nèi)生真菌形成互惠互利的菌根共生關(guān)系，這種關(guān)系在蘭科植物的生活史中扮演著重要作用。首先，菌根真菌能促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)。蘭科植物種子僅有原胚，自身貯存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，自然條件下萌發(fā)困難，需依靠真菌的侵染提供營(yíng)養(yǎng)才能萌發(fā)。Bernard首次從蘭科鳥(niǎo)巢蘭屬(Neottia)植物中發(fā)現(xiàn)促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)的菌根真菌，并提出了蘭科植物種子自然條件下靠消化菌根真菌才能萌發(fā)的經(jīng)典的共生萌發(fā)理論(Selosse et al, 2011)。Tan et al(2014)從120多種蘭科植物中分離并篩選獲得了12種促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)的菌根真菌，其中金釵石斛菌根真菌JC-02和JC-05，可顯著促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)。這些優(yōu)良菌根真菌的發(fā)現(xiàn)，為今后有效利用真菌進(jìn)行田間栽培試驗(yàn)奠定了菌種基礎(chǔ)。其次，菌根真菌能促進(jìn)蘭科植物幼苗生長(zhǎng)和發(fā)育。Guo & Cao(2000)率先利用菌根共生技術(shù)解決石斛屬植物的資源再生難題，先后從石斛屬植物中發(fā)現(xiàn)7種可與鐵皮石斛幼苗共生的真菌，對(duì)幼苗具有顯著促生作用。同時(shí)，菌根真菌也是植物組培苗產(chǎn)生藥用成分的重要誘導(dǎo)因子(Selosse et al, 2011)。

目前，通過(guò)組織培養(yǎng)繁育白及的研究已取得一定的進(jìn)展(魯光耀, 2015)，但試管苗存在著退化、移栽成活率低、生長(zhǎng)緩慢、活性成分偏低等諸多現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)白及的研究主要集中在化學(xué)、藥理、組織培養(yǎng)和引種馴化等方面，而對(duì)于白及內(nèi)生真菌分離鑒定及多樣性研究的報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)白及內(nèi)生真菌及多樣性進(jìn)行研究，旨在為深入研究白及與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系提供可利用的菌種資源，為在生產(chǎn)實(shí)踐中有效地利用白及內(nèi)生真菌提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料供試材料為2株野生白及，采自廣西桂林市資源縣(海拔1 350 m； 110°63′ E，26°03′ N)。

1.1.2 分離培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌。PDA培養(yǎng)基的配方及制作：馬鈴薯200 g，洗凈后去皮切成小塊，開(kāi)水煮30 min，4層紗布過(guò)濾，取濾液加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加熱至完全溶解，加入蒸餾水定容1 000 mL，pH自然。121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離方法選取健康白及植物的根和葉，在自來(lái)水下沖洗干凈，切成1 cm的小段。在無(wú)菌條件下，先用70%的酒精浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉浸泡消毒3～5 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，去除殘留的次氯酸鈉。用無(wú)菌濾紙，吸取材料表面的水分，然后用手術(shù)刀將材料切成5 mm(根)或5 mm × 5 mm(葉)，接種至含有硫酸鏈霉素(50 mg·L-1)和四環(huán)素(50 mg·L-1)的 PDA培養(yǎng)基，25 ℃暗培養(yǎng)7～15 d。每皿接種組織塊9塊，根和葉均重復(fù)5皿，每個(gè)器官接種45塊組織。

1.2.2 內(nèi)生真菌的純化及保藏待組織塊邊緣長(zhǎng)出真菌菌絲，及時(shí)將菌絲接種至新鮮的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)；當(dāng)菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)基的2/3面積時(shí)，根據(jù)菌落的形態(tài)特征(生長(zhǎng)速度、顏色、氣生菌絲有無(wú)等)，合并相同菌株；將形態(tài)各異純化后的內(nèi)生真菌菌株分為兩部分，一部用于4 ℃或-80 ℃保藏，另一部分用于真菌形態(tài)鑒定。

表 1　白及根和葉可培養(yǎng)內(nèi)生真菌種群組成Table 1　Culturable endophytic fungi isolated from roots and leaves of Bletilla striata

圖 1　基于rDNA-ITS 建立的NJ系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，顯示15株白及內(nèi)生真菌與其他相關(guān)類群真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以Armillaria sinapina為外類群。Bootstrap值≥50%顯示在每個(gè)分支的節(jié)點(diǎn)上。Fig. 1　Phylogenetic relationships among fifteen endophytic fungi from B. striata and fungi associated with other related taxa Armillaria sinapina was used as the outgroup. Bootstrap values (≥50%) are indicated along to relevant nodes.

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定主要參考《真菌鑒定手冊(cè)》及其他已發(fā)表的文獻(xiàn)資料(魏景超，1979; Ellis, 1971; Bailey & Jeger, 1992; Nontachaiyapoom et al, 2010; Chen et al, 2010)，根據(jù)宏觀的菌落特征和顯微特征，對(duì)分離到的白及內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定，確定真菌的分類地位。

1.2.3.1 顯微特征觀察采用透明膠帶粘取菌絲，置于表面加有1滴10% KOH的載玻片上，在生物顯微鏡下，觀察分生孢子和孢子梗的大小、形狀、顏色、表面紋飾、產(chǎn)孢方式等，并進(jìn)行測(cè)量和拍照。為了觀察自然生長(zhǎng)的菌絲形態(tài)，可以用插片法在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)真菌。

1.2.3.2 繁殖結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)內(nèi)生真菌大多數(shù)不產(chǎn)生分生孢子，往往需要誘導(dǎo)產(chǎn)孢。本研究采用低溫誘導(dǎo)法、紫外線照射法等培養(yǎng)真菌，促使真菌產(chǎn)生繁殖結(jié)構(gòu)和分生孢子，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.4 內(nèi)生真菌的分子鑒定利用ITS-rDNA進(jìn)行內(nèi)生真菌分子鑒定。參照真菌DNA提取試劑盒的使用指南進(jìn)行總DNA的提取(E. Z. N. ATM Fungal DNA Kit，Omega BioTek，Doraville，Georgia，USA)；采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTG-CGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATFGATATGC-3′)擴(kuò)增ITS1，5.8S和ITS2全序列。50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Mix 25 μL；引物各2 μL (5 μmol·L-1)；模板2～10 μL；ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸25 s；共30個(gè)循環(huán)后，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察，有條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序所用引物與擴(kuò)增反應(yīng)相同。將獲得的目標(biāo)ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)分析，利用Clustal W1.6軟件進(jìn)行全序列比對(duì)，并用MEGA 4.0.2軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分子鑒定。

1.3 內(nèi)生真菌多樣性分析

本研究采用相對(duì)多度和多樣性指數(shù)度量白及根和葉組織中內(nèi)生真菌的豐度。內(nèi)生真菌相對(duì)多度可以反映某種內(nèi)生真菌在該物種中出現(xiàn)的頻率；多樣性指數(shù)則能反映白及內(nèi)生真菌種群的豐富程度，用來(lái)分析其物種的多樣性。

相對(duì)多度(relative abundance，RB)是指分離得到的某種內(nèi)生真菌菌株數(shù)量占該植物內(nèi)生真菌總菌株數(shù)量的百分率。

內(nèi)生真菌的多樣性參照香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener diversity index，H′)的公式進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

式中，k代表內(nèi)生真菌的總分離株數(shù)；Pi代表某種內(nèi)生真菌占總菌株數(shù)的百分比(Pielou, 1975)。

2　結(jié)果與分析

2.1 白及內(nèi)生真菌的分離與鑒定

采用組織塊分離法從野生白及葉和根中，分離獲得37株可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，經(jīng)菌落特征和真菌顯微特征的觀察，分為15個(gè)分類單元。然而，這些內(nèi)生真菌往往不產(chǎn)生分生孢，影響了進(jìn)一步的分類鑒定。因此，基于ITS-rDNA序列信息，以Armillariasinapina為外類群，構(gòu)建白及內(nèi)生真菌與其他相關(guān)真菌類群的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。

通過(guò)分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可將這15株真菌分為9個(gè)屬，涉及2門(mén)4綱7目8科。子囊菌亞門(mén)真菌有7種，擔(dān)子菌亞門(mén)真菌有2種。這些子囊菌包括錘舌菌綱(Leotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和糞殼菌綱(Sordariomycetes)。其中，糞殼菌綱的種類最多。刺盤(pán)孢菌屬(Colletotrichum)和蠟殼菌屬(Sebacina)真菌為優(yōu)勢(shì)菌群，均占總分離菌株數(shù)的20%(表1)。

2.2 白及根和葉中內(nèi)生真菌的分布

4種擔(dān)子菌均分離于根中，其中，蠟殼菌屬(Sebacinasp.1)(BS11)、Sebacinasp.2(BS12)、Sebacinasp.3(BS13)等3種和膠膜菌屬(Tulasnellasp.)(BS14)1種。另外，2種鐮孢菌屬(Fusariumsp.1)(BS7)和sp.2(BS8)、1種背芽突霉屬(Cadophorasp.) (BS1)、2種刺盤(pán)孢菌屬(Colletotrichumsp.1) (BS2)和Colletotrichumsp.2 (BS3)、2種柱孢菌屬(Cylindrocarponsp.1) (BS5)、Cylindrocarponsp.2 (BS6)和1種輪枝孢菌屬(Verticilliumsp.) (BS15)由根組織中分離獲得。從葉片分離到1種刺盤(pán)孢菌屬(Colletotrichumsp.3) (BS3)、1種黑團(tuán)孢霉屬(Periconiasp.) (BS10)、1種球座菌屬(Guignardiasp.) (BS9)。

2.3 白及內(nèi)生真菌多樣性

內(nèi)生真菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H=1.483，其中，根組織中內(nèi)生真菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H=1.8638，葉組織中Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H=1.098。

3　討論與結(jié)論

對(duì)廣西野生白及根和葉組織中內(nèi)生真菌的分離和鑒定結(jié)果表明，不同組織器官中的內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類及多樣性存在較大的差異。這種差異性的出現(xiàn)在以往的研究中得到證實(shí)。譚小明等(2014)從瀕危藥用植物八角蓮根莖葉中分離到內(nèi)生真菌以根中最多。而陳佳昕等(2008)從藥用植物茅蒼術(shù)葉中分離到14株內(nèi)生真菌，而根和莖各只有一株；周雅琴等(2015)對(duì)廣西野生南方紅豆杉內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，從莖中分離獲得的內(nèi)生真菌比根和葉多。這種差異性與不同植物內(nèi)生真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求的特殊性可能相關(guān)；不同植物生長(zhǎng)的宏觀因素，如季節(jié)、年限、干濕等，以及植物體內(nèi)微環(huán)境如化學(xué)成分組成及植物結(jié)構(gòu)，也可能是影響植物內(nèi)生真菌種群和數(shù)量及多樣性的重要因子。

組織塊分離法是植物內(nèi)生真菌多樣性研究的方法之一。這一方法可以獲得可以培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，但由于人工合成培養(yǎng)基的局限性，不是所有的內(nèi)生真菌都能夠在人工合成的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這一類內(nèi)生真菌被稱為未培養(yǎng)真菌。Amann et al(1995)的研究表明，自然界中有85%～99.9%的內(nèi)生真菌是無(wú)法在培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)的。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)如宏基因組測(cè)序方法也常應(yīng)用于內(nèi)生真菌多樣性的研究，讓人們能更全面地認(rèn)識(shí)植物內(nèi)生真菌的種類和多樣性，當(dāng)然也包括未培養(yǎng)內(nèi)生真菌；但無(wú)法獲得可用于培養(yǎng)的內(nèi)生真菌。因此，組織塊分離法還是目前植物內(nèi)生真菌研究的主要方法。

所有蘭科植物都與菌根真菌存在密切的共生關(guān)系。這些菌根真菌大多屬于擔(dān)子菌。在本研究中，從根中分離獲得3種蠟殼菌屬真菌和1種膠膜菌屬(Tulasnella)真菌。研究表明，蠟殼菌屬和膠膜菌屬真菌是蘭科植物菌根真菌中常見(jiàn)的種類(Nontachaiyapoom et al, 2010)，這些真菌有的可以促進(jìn)植物種子的萌發(fā)，有的可以促進(jìn)植物生物量的增加，或增強(qiáng)植物的抗逆能力。因此，開(kāi)展蠟殼菌屬和膠膜菌屬真菌與白及植物的共生關(guān)系研究，將是下一步工作的重點(diǎn)。

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Divetsity of endophytic fungi associated withBletillastriata

WEI Yan-Mei, ZHOU Ya-Qin, LI Li, TAN Xiao-Ming*

( National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development, National Development andReformCommission,GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlant, Nanning 530023, China )

Bletillastriata, as atraditional Chinese herbal medicine, is a terrestrial and perennial medicinal plant. It is necessary to obtain the culturable endophytic fungi in the application of mycorrhizal technology for the protection and artificial cultivation ofB.striata. The independent fungal isolates were isolated from the roots and leaves ofB.striata, and identified based on the fungal morphological characteristics and the analysis of the fungal internal transcribed spacer (ITS) of rDNA sequences. The results showed that thirty-seven independent fungal isolates were obtained from forty-five root tissues and forty-five leaf tissues of two wild plants ofB.striata. The isolates were identified to 15 taxa, belonging to nine genera，eight families, seven orders，four classes, and two phyla. The four classes are corresponding to Leotiomycetes, Dothideomycetes, Sordariomycetes and Agaricomycetes. Twelve endophytic fungi were isolated from the roots, andSebacina were dominant genus. Three endophytic fungi were isolated from the leaves, andColletotrichumwere dominant genus. The relative abundance ofSebacina orColletotrichumwas 20%. Four basidiomycetes all were not isolated from the leavf tissues but the roots. The diversity index of endophytic fungi in roots (H′=1.863) was higher than that in leaves (H′=1.098). The positive results in this report demonstrated that fungi isolated fromB.striatacould be used for the protection and artificial cultivation of the host. Moreover, these Basidiomycetous fungi simultaneously clould be used as a valuable candidate sources for the protection and sustainable utilization of orchid resources by mycorrhizal technology.

Bletillastriata, culturable endophytic fungi,Sebacina, diversity, identification

10.11931/guihaia.gxzw201512004

2015-12-03

2016-04-14

廣西自然科學(xué)基金(2015GXNSFDA139012)；廣西藥用植物園科研基金(桂藥基201401)[Supported by the Natural Science Foundation of Guangxi(2015GXNSFDA139012)；Research Fund of Guangxi Medicinal Botanical Garden(201401)。]

韋艷梅(1983-)，女(壯族)，廣西都安人，碩士，工程師/助理研究員，主要從事園林景觀建設(shè)、植物栽培研究,(E-mail) weiyanmei99@126.com。

譚小明，博士，副研究員，主要從事藥用植物菌根生物學(xué)研究，(E-mail) txm1978@126.com。

Q943

A

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