M i c roRN A-126和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在胚胎停育絨毛組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究*

彭燕，莫吉祥，王新

（1.湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 婦產(chǎn)科教研室，湖南 湘潭 411100；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

論著

M i c roRN A-126和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在胚胎停育絨毛組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究*

彭燕1，莫吉祥1，王新2

（1.湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 婦產(chǎn)科教研室，湖南 湘潭 411100；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

目的通過(guò)分析孕早期胚胎停育與正常胚胎絨毛組織中m i c ro R NA-126（m i R-126）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（V E G F）的表達(dá)差異，探討其在早期胚胎停育中的相關(guān)性。方法收集孕早期胚胎停育和正常胚胎絨毛組織各28例作為胚胎停育組和對(duì)照組，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（R T-P C R）檢測(cè)兩組m i R-126和V E G F mR NA表達(dá)水平的變化。結(jié)果①兩組絨毛組織中均有m i R-126表達(dá)，胚胎停育組絨毛組織中m i R-126的表達(dá)高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②胚胎停育組絨毛組織中V E G F的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③胚胎停育組絨毛組織中m i R-126與V E G F的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；對(duì)照組絨毛組織中m i R-126與V E G F的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論①胚胎停育絨毛組織中V E G F的表達(dá)低于正常胚胎。②V E G F的表達(dá)變化與胚胎停育的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

胚胎停育；絨毛組織；m i c ro R NA-126；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

胚胎停止發(fā)育是指妊娠早期因某種原因引起胚胎發(fā)育停止、胚胎死亡，最終結(jié)局常表現(xiàn)為稽留流產(chǎn)和不全流產(chǎn)。近年來(lái)，胚胎停育發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)。有學(xué)者認(rèn)為，胎盤(pán)形成過(guò)程中血管功能不全可能是導(dǎo)致胚胎停育的眾多原因之一［1］。

M icro R N A（mi R）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化上非常保守、穩(wěn)定性好的內(nèi)源性非編碼小分子R N A，已成為生物學(xué)一個(gè)研究的熱點(diǎn)。mi R-126在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，具有促進(jìn)胚胎新生血管形成并維持管壁完整性的作用［2-3］。有資料表明，mi R-126過(guò)表達(dá)能明顯增加內(nèi)皮先祖細(xì)胞的集落形成、增殖，減少細(xì)胞凋亡［4］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（v asc u lar endothelial g ro w th f actor，V E G F）是目前所知道的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)［5］。

mi R-126和V E G F作為兩種對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起作用的因子，在妊娠過(guò)程中的重要性是顯而易見(jiàn)的。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，V E G F是mi R-126的預(yù)測(cè)靶基因之一。但目前國(guó)內(nèi)外在mi R-126對(duì)V E G F的相關(guān)性方面研究較少，并且主要集中在腫瘤方面的研究，而在胚胎停育方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本課題采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（re v erse transcriptionpolymerase chain reaction，R T-PC R）法分析胚胎停育絨毛組織中mi R-126、V E G F m R N A的表達(dá)，進(jìn)而探討兩者與胚胎停育發(fā)病的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2012年11月1日-2013年1月31日在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的胚胎停育和正常妊娠要求人工流產(chǎn)患者的絨毛組織各28例。其中，年齡19～33歲；孕周7～10周，均為漢族。納入標(biāo)準(zhǔn)：初孕婦，既往月經(jīng)規(guī)則，停經(jīng)49～70 d，近3月未服用激素類藥物，妊娠期間無(wú)明顯感染病史，血常規(guī)、凝血功能正常，白帶常規(guī)無(wú)明顯異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌異常，詢問(wèn)無(wú)糖尿病、心血管疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺功能異常等其他全身性疾病病史，否認(rèn)家族遺傳性疾病，近期無(wú)用藥、手術(shù)創(chuàng)傷史，無(wú)不良的生活習(xí)慣。參照G UO等［6］的診斷依據(jù)，收集胚胎停育患者絨毛組織標(biāo)本28例作為胚胎停育組；同時(shí)收集早期正常妊娠自愿要求行人工流產(chǎn)手術(shù)患者絨毛組織標(biāo)本28例作為對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1絨毛組織總R NA提取和質(zhì)量檢測(cè)將兩組絨毛組織各100m g勻漿研磨，Tri z ol一步法提取組織總R N A。每組各取樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260和280 nm波長(zhǎng)的光密度值（optical density，O D）。經(jīng)電泳觀察條帶。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)mi R-126及內(nèi)參U6引物購(gòu)自廣州復(fù)能公司（H mi R Q0098）（見(jiàn)表1）。V E G F及內(nèi)參β-actin從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心下載，引物設(shè)計(jì)采用P rimer 5.0軟件（見(jiàn)表2）。

表1　m i R-126及內(nèi)參U6的引物序列

表2　V EGF和內(nèi)參β-a c t i n的引物序列

1.2.3c DNA的合成采用美國(guó)F ermentans公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDN A的合成。

1.2.4R T-P C R檢測(cè)采用日本Toyobo公司的S YB R G reen q PC R M i x試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行PC R擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20μl。

1.32-ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究的R T-PC R數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，用內(nèi)參U6/β-actin對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布的計(jì)量資料經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再行統(tǒng)計(jì)分析；兩組間的比較行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析用P earson相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　總RN A瓊脂糖凝膠電泳圖

2　結(jié)果

2.1總RN A結(jié)果

兩組絨毛組織中總R N A呈乳白色半透明狀，經(jīng)1%變性瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察，可見(jiàn)3條明顯電泳條帶：r R N A 28S，r R N A 18S，r R N A 5 S（見(jiàn)圖1）。r R N A 28 S和r R N A 18S兩條帶明顯、清晰、無(wú)任何拖尾條帶出現(xiàn)，并且28 S條帶的亮度明顯亮于18S條帶，紫外光分光光度儀測(cè)定其O D260/O D280比值為1.8～2.0，提示本實(shí)驗(yàn)所提取的R N A純度高、完整性好，可以滿足R T-PC R實(shí)驗(yàn)的需要。

2.2兩組絨毛組織中m i RN A-126的表達(dá)

mi R-126在兩組絨毛組織中均有表達(dá)，且兩組mi R-126表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.571）。見(jiàn)表3。

2.3兩組絨毛組織中V EGF的表達(dá)

V E G F在兩組絨毛組織中均有表達(dá)。胚胎停育組V E G F的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 13.874，P=0.000）。見(jiàn)表4。

2.4胚胎停育組絨毛組織中m i R-126、V EGF表達(dá)的相關(guān)性分析

P earson直線相關(guān)分析結(jié)果表明，胚胎停育組絨毛組織中mi R-126與V E G F的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，對(duì)照組絨毛組織中mi R-126與V E G F的表達(dá)呈正相關(guān)。

見(jiàn)圖2、3。

表3　兩組絨毛組織中m i R-126的表達(dá)比較

表4　兩組絨毛組織中V EGF的表達(dá)比較

圖2　胚胎停育組m i R-126、V EGF表達(dá)的相關(guān)性

圖3　對(duì)照組m i R-126、V EGF表達(dá)的相關(guān)性

3　討論

3.1m i R-126與胚胎停育的相關(guān)性

胚胎/胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育與滋養(yǎng)細(xì)胞的有效侵入及胎盤(pán)絨毛血管發(fā)育關(guān)系密切，而胎盤(pán)絨毛血管的形成過(guò)程實(shí)際上就是血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。mi R-126基因組定位于表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7（epidermal g ro w th f actor-li k edomain 7，E G F L7）基因的第7個(gè)內(nèi)含子中，而E G F L7本身就是血管內(nèi)皮特異性表達(dá)的基因，因而兩者共同作用對(duì)血管的形成、發(fā)育及功能起調(diào)控作用［7］。S E H MI DT等［8］研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠的E G F L7基因敲除后，部分胚胎死于血管發(fā)育缺陷及異常的胚胎干細(xì)胞聚集，提示在實(shí)驗(yàn)中可能不僅敲除E G F L7基因，還敲除編碼mi R-126的基因［9］。本實(shí)驗(yàn)用R T-PC R檢測(cè)胚胎停育組和對(duì)照組絨毛組織中mi R-126的表達(dá)水平。結(jié)果表明mi R-126在兩組中均有表達(dá)，胚胎停育組的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1.16倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡艿脑?yàn)椋孩傺苄律赡苁芏喾Nmi R的共同調(diào)控。②mi R-126在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中可能并未直接參與調(diào)節(jié)絨毛血管的形成。③本次實(shí)驗(yàn)樣本量較少，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)造成一定的局限性。

3.2V EGF與胚胎停育的相關(guān)性

V E G F又稱血管調(diào)理素或血管通透因子，是至今為止發(fā)現(xiàn)的最有力的血管生成因子，在妊娠中發(fā)揮重要作用［10］。近年來(lái)研究表明，V E G F功能及表達(dá)異?？梢鹋咛ブ踩爰疤ケP(pán)血管網(wǎng)形成障礙，提示V E G F是造成自然流產(chǎn)的重要原因之一［11］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用R T-PC R檢測(cè)胚胎兩組絨毛組織中V E G F m R N A的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胎停育組絨毛組織中V E G F的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，這提示胚胎停育發(fā)病機(jī)制之一是絨毛組織內(nèi)V E G F表達(dá)水平下降，結(jié)合V E G F生理作用及其在妊娠中的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)其可能原因?yàn)椋孩賄 E G F表達(dá)下降，可減弱內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖功能，導(dǎo)致蛻膜血管、絨毛血管等生成減少，造成絨毛內(nèi)血流量減少，影響到胚胎的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致胚胎停育；②V E G F表達(dá)下降，導(dǎo)致絨毛組織植入子宮內(nèi)膜過(guò)淺，形成絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞淺著床，導(dǎo)致流產(chǎn)或母胎間營(yíng)養(yǎng)交換障礙，胚胎停止發(fā)育；③V E G F表達(dá)下降，能下調(diào)與血管通透性相關(guān)的活性物質(zhì)的表達(dá)，影響母胎間的營(yíng)養(yǎng)交換，導(dǎo)致胚胎生長(zhǎng)發(fā)育受阻，甚至胚胎停育。

3.3m i R-126、V EGF在胚胎停育中的相關(guān)性

通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，E G F、S pred1是 mi R-126眾多預(yù)測(cè)靶基因中的2個(gè)基因［12］。mi R-126在早期胚胎發(fā)育方面是否存在對(duì)V E G F的調(diào)節(jié)，尚不清楚。F I S H等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育方面，mi R-126可通過(guò)抑制 S pred1和PI K3R2 m R N A水平表達(dá)，提高內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)V E G F和堿性成纖維因子（basic f ibroblast g ro w th f actor，b F G F）的敏感性，參與胚胎新生血管形成，并維持血管的完整性。由此可以看出，mi R-126與V E G F呈正相關(guān)。但是L I U等［14］研究mi R-126在肺癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)mi R-126可以明顯抑制V E G F的表達(dá)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起抑制作用。從L I U的研究中可以看出，mi R-126與V E G F呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討mi R-126和V E G F在胚胎發(fā)育方面的相關(guān)性，對(duì)兩組絨毛組織中mi R-126與V E G F的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者在胚胎停育組中呈負(fù)相關(guān)，提示mi R-126與V E G F在胚胎停育的發(fā)生、發(fā)展中有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。這與L I U［14］和張昱等［15］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。而兩者在對(duì)照組中卻呈正相關(guān)，提示mi R-126與V E G F在胚胎正常的發(fā)育過(guò)程中有正向調(diào)節(jié)作用。這與F I S H等［13］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此筆者推測(cè)，同一種mi R N A在不同的生理、病理過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)控不同的靶基因而發(fā)揮不同的作用。mi R-126在正常妊娠時(shí)可通過(guò)抑制S pred1基因，提高內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)V E G F和b F G F的敏感性，參與胚胎血管的新生并維持血管的完整性。而在胚胎停育時(shí)，mi R-126則可能通過(guò)直接抑制V E G F基因的表達(dá)，從而使胚胎血管發(fā)育減少或功能異常。

胚胎停育發(fā)病因素復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未明確，相信隨著胚胎停育方面mi R研究的逐漸深入，有望通過(guò)干擾mi R-126的調(diào)控作用而減少胚胎停育的發(fā)生，并且為臨床早期監(jiān)測(cè)胚胎發(fā)育及治療胚胎停育提供新的靶點(diǎn)。

［1］葉玲玲，張碧云，曹文麗.子宮頸支原體感染與胚胎停止發(fā)育的關(guān)系［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39（2）:83-85.

［2］H A RR I S T A，Y A M A KU C H I M，F(xiàn) E RL I T O M，et al.M icro R N A-126 re g u lates endothelial e x pression o f v asc u lar cell adhesion molec u le 1［J］.P roc Natl A cad S ci U S A，2008，105（5）:1516-1521.

［3］C A P O R A L I A，E M A N U C L I C.M icro R N A re g u lation in an g iog enesis［J］.V asc u l P harmacol，2011，55（4）:79-86.

［4］M EN G S，C A O J T，Z H A N G B，et al.Do w nre g u lation o f micro R N A-126 in en g othelial pro g enitor cells f rom diabetes patients，impairs their fu nctional propertics，v is tar g et g ene S pred-1［J］.J M ol C ell C ardiol，2012，53（1）:64-72.

［5］BU C H L E R P，R E B E R H A，BU C H L E R M W，et al.V E G F-R Ⅱ in f l u ences the pro g nosis o f panc reatic cancer［J］.A nn Su r g，2002，236（6）:728-749.

［6］G UO J，Z OU L.C orrelation o f R E C K w ith matri x metalloproteinase-2 in re g u lation o f trophoblast in v asion o f early pre g nancy［J］. H u a z hon g U ni v S ci Technolo g M ed S ci，2006，26（6）:738-740.

［7］王雪婷，羅明.微小R N A-126在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能［J］.國(guó)際心血管病雜志，2014，41（1）:4-6.

［8］S E H MI DT M，P A E S K，DE M A Z IéR E A，et a1.E G F L7 re g ulates the colleti v e mi g ration o f endothelial cells by restrictin g their spatial distrib u tion［J］.De v elopment，2007，134（16）:2913-2923.

［9］KUH NE R T F，M A N C U S O M R，H A MP T O N J，et a1.A ttrib u tion o f v asc u lar phenotypes o f the m u rine E g f l7 loc u s to the micro RN A mi R-126［J］.De v elopment，2008，135（24）:3989-3993.

［10］吳英，陳丹，王波.可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1與子癇前期的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2012，39（6）:560-563.

［11］杜麗榮，徐素欣.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在自然流產(chǎn)領(lǐng)域的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，2（4）:18-20.

［12］A L E X I OU P，V E R G OU L I S T，G L ED I T ZS C H M，et al.mi R G en 2.0:a database o f micro R N A g enomic in f ormation and re g u lation［J］.N u cleic A cids R es，2010，38:137-141.

［13］F I S H J E，S A NT O R O M M，M O R T O N S U，et al.M i R-126 re g u lates an g io g enic si g nalin g and v asc u lar inte g rity［J］.De v C ell，2008，15（2）:272-284

［14］L I U B，P EN G X C，Z H EN G X L，et al.M i R-126 restoration do w n-re g u late V E G F and inhibit the g ro w th o f l u n g cancer cell lines in v itro and in v i v o［J］.Lu n g C ancer，2009，66:169-175.

［15］張昱.靶向V E G F的mi R-126在結(jié)直腸癌侵襲和血管生成過(guò)程中的調(diào)控作用［D］.廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

（申海菊 編輯）

Expressions of m icroRNA-126 and VEGF in chorionic villi of grow th-arrest early embryo and their correlation*

Yan Peng1，Ji-xiang Mo1，Xin Wang2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Xiangtan Vocational and Technical College，Xiangtan，Hunan 411100，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410011，China）

Objective To investigate the expressions of microRNA-126（miR-126）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in the chorionic villi of growth-arrest early embryo group and the chorionic villus of normal control group，and analyze the different expressions of miR-126 and VEGF between them so as to explore their relationship in early embryo growth arrest.Methods The chorionic villi of 28 cases in early embryo growth arrest group and 28 cases in control group were collected.Using reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），the expression levels of miR-126 and VEGF mRNA in the two groups were detected.Results miR-126 was expressed in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group and the control group.The expression of miR-126 in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group was higher than that of the control group，but the difference was not significant.The expression of VEGF in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group was significantly lower than that of the control group，the difference was statistically significant.Anegative correlation was found between miR-126 and VEGF in the chorionic villi of the early embryo growth arrest group，while a positive correlation was found between miR-126 and VEGF in the chorionic villi of the control group.Conclusions The expression of VEGFin the chorionic villi of growth-arrest early embryo is lower than that in normal chorionic villi.There is a certain correlation between the change of VEGF expression and the early embryo growth arrest.

early embryo growth arrest；chorionic villus；miR-126；vascular endothelial growth factor

R 715.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.014

1005-8982（2016）15-0076-05

2015-11-24

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（No：14C1111）