白　豆，龍　玲，朱乃碩,3

(1. 復旦大學 生命科學學院 微生物學與微生物工程系，上海 200438；2. 復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；3. 復旦大學 生物醫(yī)學研究院，上海 200438)

?

一株產1-脫氧野尻霉素(DNJ)枯草芽孢桿菌黑色變種的誘變育種研究

白豆1,2，龍玲1,2，朱乃碩1,2,3

(1. 復旦大學 生命科學學院 微生物學與微生物工程系，上海 200438；2. 復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；3. 復旦大學 生物醫(yī)學研究院，上海 200438)

1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin, DNJ)是一種哌啶生物堿，是α-葡萄糖苷酶的強抑制劑，具有降低餐后血糖、抗腫瘤轉移和抗病毒等作用.目前工業(yè)生產的DNJ主要是從桑葉中提取的，價格昂貴.為了獲得DNJ的穩(wěn)定高產菌株，本文通過對產DNJ枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillussubtilisvar.niger)分別采用紫外線誘變、亞硝基胍誘變和60Coγ射線誘變方法，得到發(fā)酵培養(yǎng)液DNJ表達量達20.7mg/L的菌株，其表達量較初始菌株產量提高了27.7%，并對細菌的DNJ合成代謝相關基因進行了克隆和測序，菌株命名為B-231.

1-脫氧野尻霉素； 枯草芽孢桿菌黑色變種； 誘變育種

1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin, DNJ)是一種哌啶生物堿，化學名稱為3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶.是一種存在于植物、微生物及蠶體中[1-3]的天然糖類似物，自然界以桑樹中含量最高，也可通過化學合成或半合成方法得到[4]，為強效的糖代謝酶抑制劑(比如α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等)，可顯著延緩多糖的降解過程，降低餐后血糖的峰值，穩(wěn)定空腹血糖[5].并且，還有減肥及增加胰島敏感性、抗病毒、抗腫瘤轉移[6-8]等作用，在醫(yī)藥和保健品有廣泛的應用.此外，DNJ也可用于食品領域，以桑葉為原料的食品，作為功能性降糖的產品在日本等東亞國家已經允許在市場上銷售[9]，顯示出DNJ在保健食品領域的廣闊前景.

目前，醫(yī)藥上所用的DNJ基本上都是從桑葉提取的，一方面天然產物中DNJ含量較低，另一方面，DNJ的分離純化較為復雜,再加上提取過程中的損失，產量很低.而人工DNJ合成難度較大，成本高，不適于大規(guī)模的生產.故目前DNJ商品價格十分昂貴，含量20%的粗提物售價即可高達2000元/kg.而微生物生產DNJ方面，僅限于產DNJ菌株的篩選與鑒定，沒有開展大規(guī)模微生物發(fā)酵制備DNJ方面的報道.鑒于微生物發(fā)酵生產DNJ具有投資小、見效快、方法簡單等優(yōu)點，故可通過微生物大規(guī)模發(fā)酵實現DNJ的大規(guī)模生產.

枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillussubtilisvar.niger)菌株是本實驗保存的一株生產DNJ的菌株，經檢測發(fā)酵液中的DNJ濃度為16.2mg/L.該菌株是野生型菌株，發(fā)酵產物含量較低，還不能滿足工業(yè)化生產的要求，本文分別采用紫外線誘變、以亞硝基胍(NTG)為誘變劑的化學誘變和60Coγ射線誘變技術對枯草芽孢桿菌黑色變種進行誘變處理，以期獲得DNJ穩(wěn)定高產的菌株.

1　材料與方法

1.1菌種、試劑與儀器

枯草芽孢桿菌黑色變種Bacillussubtilisvar.niger(FSCC115051)，本實驗室保存；1-脫氧野尻霉素(DNJ)，上海世峰生物科技有限公司;芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)，J&K Chemical；乙腈(色譜純)，Sigma公司；α-葡萄糖苷酶溶液，0.8%的大鼠小腸丙酮粉溶解于0.1mol/L的PBS(pH 6.8)中，離心，取上清備用；對硝基苯酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，1.25mmol/L；其余試劑為分析純，水為實驗室自制超純水.高效液相色譜儀Ultimate3000，美國戴安公司，色譜柱為Phenomenex luna C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測器為DIONEX RF-3000紫外檢測器；熒光多功能酶標儀Spectrum M5，Molecular Device公司等.

1.2方法

1.2.1發(fā)酵液中DNJ的含量的檢測

用α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗間接半定量檢測細菌發(fā)酵液中DNJ的含量，并且可以對誘變后的細菌進行大批量的初步篩選.將DNJ標準品稀釋為0.002，0.004，0.008，0.016，0.032，0.064，0.128mg/mL的7個標準濃度，參考Kyung等[10]的方法，在96孔板中依次加入緩沖液PBS、底物對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷pNPG、待檢測細菌培養(yǎng)液上清/DNJ、α-葡萄糖苷酶溶液，總體積200μL，置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中，37℃反應1h，最后加入終止液Na2CO3，終止反應.后把96孔板置于熒光多功能酶標儀中，在405nm處掃描其吸光度.根據公式如下公式，計算抑制率：

1.2.2RT-HPLC測定細菌發(fā)酵液中DNJ的含量

取DNJ標準液(濃度為0.0025，0.005，0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32mg/mL)和菌液各50μL于1.5mL的EP管中,加入0.4mol/L的K3BO3(pH 8.5)20μL,再加入5mmol/L的衍生化試劑FMOC-Cl(溶解于50%乙腈中)50μL，立即混勻.25℃恒溫干式金屬浴中反應25min,再加體積分數為1%的醋酸溶液800μL,反應液經過0.22μm的微孔濾膜過濾，濾液進行色譜分析，流動相為乙腈∶0.1%醋酸(體積比=11∶16)，流速為1.0mL/min，進樣量100μL.

1.2.3存活率與致死率計算

存活率與致死率的計算采用如下公式：

存活率=0.1mL誘變后菌液中的活菌數÷0.1mL對照菌液中的活菌數；

死亡率=(0.1mL對照菌液中的活菌數-0.1mL誘變后菌液中的活菌數)/0.1mL對照菌液中的活菌數.

1.3誘變

1.3.1紫外線誘變

取2次5mL發(fā)酵液于10mL離心管中，以3000r/min 4℃離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩洗滌3次，離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩均勻，調整懸液的濃度為108CFU/mL.將原液稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-64個濃度，每個濃度取5mL稀釋液于直為9cm的平皿中，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射0.5，1，2，3，5min，操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，避免白熾光.取未經紫外線燈照射的菌液為對照，每個處理重復3次.

1.3.2亞硝基胍誘變

在用紫外線誘變處理枯草芽孢桿菌黑色變種的基礎上，通過pNPG法初步篩選表現出較高α-糖苷酶抑制能力的菌株，然后采用亞硝基胍進一步對細菌進行誘變.取10mL發(fā)酵液于10mL離心管中，以6000r/min 4℃離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩洗滌3次，離心10min，棄去上清液.加入0.1mol/L磷酸緩沖液9mL，振蕩均勻，調整懸液的濃度為108/mL.吸取NTG母液1mL，然后用pH 6.0磷酸緩沖液配制母液，使母液濃度為1mg/mL，將菌懸液和NTG母液進行混合，使混合液中亞硝基胍的濃度分別問為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4mg/mL.接著將混合液放在搖床上，在37℃，100r/min中處理30min，菌懸液4℃離心，用冷的無菌水洗滌3次以終止誘變.再加入相同體積的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)2h，度過生理延時期.

1.3.360Coγ射線輻射誘變

在用紫外線誘變處理枯草芽孢桿菌黑色變種的基礎上，通過pNPG法初步篩選表現出較高α-糖苷酶抑制能力的菌株，然后采用60Coγ射線進一步對細菌進行誘變.取10mL發(fā)酵液于10mL離心管中，以6000r/min 4℃離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩洗滌3次，離心10min，棄去上清液.加入無菌水9mL，振蕩均勻，調整懸液的濃度為107/mL.將原液稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-64個濃度，每個濃度分別吸取1mL于1.5mL EP管中.采用60Co產生的γ射線進行誘變處理.輻射源為第二軍醫(yī)大學輻射中心的60Co源裝置，在相同的輻射劑量率20Gy/min下，分別采用100，200，400，600，800，1000，1500，2000Gy 12個劑量.

1.4DNJ合成相關基因擴增與序列分析

Kang等[11]報道了BacillussubtilisMORI 3K-85中與1-脫氧野尻霉素合成有關的基因GabT1，Yktc1，GutB1分別編碼轉氨酶、磷酸酶和氧化還原酶.本實驗以參考Myung等[12]的方法分別合成引物及進行基因擴增，引物序列見表1.以菌液為模板進行PCR擴增，擴增產物送上海生工測序，將測序結果在http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上進行Blast比對.

表1　DNJ合成相關基因GabT1，Yktc1，GutB1引物

2　結果與討論

2.1pNPG法測定1-脫氧野尻霉素標準品

以DNJ濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標做a-糖苷酶方法檢測的標準曲線.如圖1所示，標準曲線方程為y=0.0945x+0.918其線性回歸系數R2=0.9929，線性關系良好.

2.2RT-HPLC法測定細菌發(fā)酵液中DNJ含量

反向高效液相色譜-紫外檢測法(RT-HPLC)分別測定DNJ標準品溶液(濃度40mg/mL)和枯草芽孢桿菌黑色變種出發(fā)菌株發(fā)酵液中DNJ的含量，在吸收圖譜中，圖2(a)為DNJ標準品溶液，在第7.94min和16.70min處出峰分別為FMOC-DNJ和FMOC-OH；圖2(b)為細菌發(fā)酵液，在第8.01min和16.86min處出峰分別為FMOC-DNJ和FMOC-OH.檢測誘變前細菌發(fā)酵液中的DNJ含量為16.2mg/L.

2.3紫外線的誘變效應

取標記好序號的未照射的制備菌液和照射菌液各0.1mL均勻涂布，37℃暗箱培養(yǎng)24h,計數活菌數.在未照射對照組，濃度為10-3的菌液的平板成片無法計數，而10-6的菌液的平板菌落太少，故選擇10-5、10-4兩個濃度梯度進行下一步實驗.

2.3.1死亡率的計算

以10-4稀釋和10-5稀釋的菌液進行的紫外誘變結果如下表，隨著紫外照射時間的延長致死率也在不斷的提高，到5min時，死亡率已達到100%，為了得到較滿意的誘變效果，我們選擇致死率約80%，90%兩個照射時間的菌株.

表2　不同時間紫外線照射處理后枯草芽孢桿菌黑色變種的死亡率

(1) 10-4稀釋菌液，(2) 10-5稀釋菌液.

2.3.2紫外線誘變后細菌生產DNJ能力鑒定

我們從菌懸液濃度分別為10-4、10-5的，誘變時間各為2min、3min的平板上各挑選24個單菌落分別置于有3mL LB液體12孔細胞培養(yǎng)板內培養(yǎng)60h.按照1.2的方法，對菌株生產DNJ的能力進行了鑒定，發(fā)現紫外線誘變的菌株中其中有3個菌株表現出較大的的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其抑制率分別為33.9%、34.7%、34.9%，其他的誘變菌株抑制α糖苷酶效果不明顯，還有出現一些負突變的菌株(數據未附上).對產DNJ菌株的具體的產能進行計算，細菌上清液中的DNJ含量分別為17.4mg/L、17.9mg/L、18.1mg/L，平均值為17.8mg/L.

2.4亞硝基胍誘變效應

2.4.1死亡率的計算

亞硝基胍處理后，不同劑量的亞硝基胍處理后菌株的存活率如表3(見第108頁)所示，亞硝基胍的致死率相當高，從菌株死亡率來看，亞硝基胍誘變的死亡率非常高，濃度為0.05mL/mL時死亡率已達到75.4%，0.03mL/mL 時死亡率已到達98.8%.

表3　不同劑量的亞硝基胍處理后枯草芽孢桿菌的死亡率

2.4.2亞硝基胍誘變后細菌生產DNJ能力鑒定

參照文獻，我們從誘變劑量為0.2mg/mL，91.4%致死率平板上各挑選24個單菌落分別置于有3mL LB液體12孔細胞培養(yǎng)板內培養(yǎng)60h.按照1.2的方法，對菌株生產DNJ的能力進行了鑒定.亞硝基胍誘變的菌株中有其中2個菌株的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為35.1%、35.4%.細菌上清液中的DNJ含量分別為18.3mg/L、18.5mg/L.其余突變菌株抑制α糖苷酶效果沒有明顯增加(數據未附上).

2.560Coγ射線輻射誘變

2.5.1死亡率的計算

60Coγ射線輻射誘變后，10-4稀釋度菌株的致死率，如表4所示，從菌株死亡率來看，當誘變劑量為100Gy時，致死率為10.5%，隨著誘變劑量的增大，死亡率也不斷上升，到1000Gy時，死亡率已達88.3%.

表4　不同劑量60Coγ射線輻射誘變后枯草芽孢桿菌黑色變種的死亡率

2.5.260Coγ射線輻射誘變后細菌產DNJ能力鑒定

我們從誘變劑量為20Gy/min，致死率為87.4%的平板上各挑選24個單菌落分別置于有3mL LB液體12孔細胞培養(yǎng)板內培養(yǎng)60h.按照1.2的方法，對60Coγ射線輻射誘變后菌株生產DNJ的能力進行了鑒定.其中有2個菌株的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為39.4%、40.0%，其余菌株抑制α糖苷酶效果沒有明顯增加(數據未附上).細菌上清液中的DNJ含量分別為20.5mg/L、20.7mg/L.如圖3所示，檢測出的DNJ含量為20.7mg/mL，在第8.063min和第16.893min出的峰分別為FMOC-DNJ和FMOC-OH.

2.6DNJ合成相關基因擴增與結果序列分析

對細菌上清液中DNJ含量為20.7mg/L的菌株中DNJ合成相關基因GabT1(約1270bp)、Yktc1(約950bp)以及GutB1(約1020bp)進行了PCR擴增,其瓊脂糖凝膠電泳結果如圖4所示.

所測得基因序列在GenBank比對之后發(fā)現，枯草芽孢桿菌黑色變種B-231中基因GabT1、Yktc1和GutB1經過Blast比對之后，發(fā)現和細菌B.amyloliquefaciensFZB42(NC_009725.1)[10]的基因分別有83%，76%，76%的相似度，圖5分別是對枯草芽孢桿菌黑色變種B-231的基因GabT1、Yktc1和GutB1進行推斷得出的氨基酸序列和細菌B.amyloliquefaciensFZB42對應基因的氨基酸序列的比對結果.

3　結　論

3.1檢測方法的問題

本實驗確定了用對硝基苯酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物、通過測定α-葡萄糖苷酶活力狀況，從而間接檢測溶液中DNJ含量的半定量方法，在DNJ含量為0.002mg/mL，即可檢出.此方法方便操作，準確性高，價格相對低廉，適合實驗室大規(guī)模誘變篩選時使用.pNPG法初步篩選到表現出較高的抑制α-葡萄糖苷酶活力的菌株，然后用RT-HPLC法進一步對細菌發(fā)酵液中的DNJ定量檢測.反向高效液相色譜法靈敏度更高，能特異性檢測DNJ.

3.2各種誘變技術的優(yōu)缺點比較

在微生物發(fā)酵工業(yè)中，菌種通過誘變育種不僅可以提高有效產物的產量，改善生物學特性，而且對于研究有效產物的代謝途徑、遺傳圖譜繪制等方面都有一定的作用.目前工業(yè)生產上所使用的菌種，幾乎都是經過誘變育種獲得的菌株.本室采用了紫外線誘變、亞硝基胍誘變和60Coγ射線誘變的方法.不同誘變劑處理枯草芽孢桿菌黑色變種菌株的結果表明，不同的誘變劑對該菌株有不同的致死效應并且有累積效應.為進一步的優(yōu)化誘變條件提供了較為詳盡的數據.其中60Coγ射線誘變的方法獲得一株高產菌株細菌發(fā)酵液中DNJ的含量比出發(fā)菌株提高了27%，平均產量達到20.6mg/L.

3.3DNJ合成相關基因

1-脫氧野尻霉素是多基因合成的菌體次生代謝產物，在鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬中均有發(fā)現，然而其代謝通路研究的并不十分透徹.本室篩選到的枯草芽孢桿菌黑色變種B-231表現出較強的抑制α-葡萄糖苷酶活力，在分析其DNJ合成相關基因的實驗中，從而為該菌株產生DNJ提供了遺傳數據基礎.本室后續(xù)實驗將對DNJ合成相關的3個基因進行研究，為進一步提高其產DNJ的能力提供了思路.

[1]ASANO N, TOMIOKA E, KIZU H,etal. Sugar with nitrogen in the ring isolated from the leaves ofMorusbombycis[J].CarbohydrateResearch, 1994,253(3)： 235-245.

[2]HARDICK D J, HUTCHINSON D W. The biosynthesis of 1-deoxynojirimycin inBacillussubtilisvar.niger[J].Tetrahedron, 1993,49(30)： 6707-6716.

[3]桂仲爭,莊大桓,陳杰,等.全蠶粉降血糖的作用效果及其機理的研究[J].蠶業(yè)學,2001,27(2)： 114-117

[4]田麗麗,李中軍,李輝.1-脫氧氮雜-D-葡萄糖(Deoxynojirimycin，DNJ)的合成[J].應用化學,2004,21(1)： 12-15.

[5]LI Y G， JI D F， ZHONG S，etal. Hybrid of 1-deoxynojirimycin and polysaccharide from mulberry leaves treat diabetes mellitus by activating PDX-1/insulin-1 signaling pathway and regulating the expression of glucokinase， phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase in alloxan—induced diabetic mice[J].JournalofAppliedEntomology， 2011,134(3)： 27-31.

[6]KONG W H, OH S H, AHN Y R,etal. Antiobesity effects and improvement of insulin sensitivity by 1-deoxynojirimycin in animal models [J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 2008,56(8)： 2613-2619.

[7]STEINMANN E, WHITFIELD T, KALLIS S,etal. Antiviral effects of amantadine and iminosugar derivatives against hepatitis C virus[J].Hepatology, 2007,46(2)： 330-338.

[8]TSURUOKA T, FUKUYASU H, ISHII M,etal. Inhibition of mouse tumor metastasis with nojirimycin-related compounds[J].JournalofAntibiotics, 1996,49(2)： 155-161.

[9]KIMURA T, NAKAGAWA K, SAITO Y,etal. Simple and rapid determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves[J].Biofactors, 2004,27(1-4)： 341-345.

[10]KYUNG K D, CHO Y S， SONG J H,etal. Identification of the genes involved in 1-deoxynojirimycin synthsis inBacillussubtilisMORI 3K-85[J].TheJournalofMicrobiology, 2011,49(3)： 431-440.

[11]CHO Y S, PARK Y S, LEE J Y,etal. Hypoglycemic effect of culture broth ofBacillussubtilisS10 producing 1-deoxynojirimycin[J].JKoreanSocFoodSciNutr, 2008,37(11)： 1401-1407.

[12]SEO M J, NAM Y D, LEE S Y, Isolation of the putative biosynthetic gene cluster of 1-deoxynojirimycin byBacillusamyloliquefaciens140N, its production and application to the fermentation of soybean paste[J].BiosciBiotechnolBiochem， 2013,77(2)： 398-401.

Mutation Breeding of a Isolated Bacillus subtilis var.niger for Producing the 1-Deoxynojirimycin

BAI Dou1,2, LONG Ling1,2, ZHU Naishuo1,2,3

(1. Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences, Fudan University,Shanghai200438,China； 2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China； 3.InstituteofBiomedicalScience,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

1-Deoxynojirimycin(DNJ) is a kind of alkaloid, known to improve diabetic conditions by inhibiting the activity ofα-glucosidase. It also plays a role in anti-tumor metastasis and antiviral activity. DNJ has been mainly isolated from the root and leaf of the mulberry tree(Morusalba) at present. However, it leads high cost. To obtain stable and high yield DNJ producing strain, in the current studyBacillussubtilisvar.nigerwhich can produce DNJ was treated with UV mutagenesis, nitrosoguanidine and60Coγ, a strain was isolated and named as B-231 finally. It produced 20.7mg/L DNJ in the fermentation broth, and the content of DNJ increased by 27.7% compared with the initial strain. More research was done on the new strain about its character in molecular biology. The genes associated with anabolism of DNJ were cloned and sequenced.

1-Deoxynojirimycin;Bacillussubtilisvar.niger; mutation breeding

0427-7104(2016)01-0104-08

2015-03-26

白豆(1985—)，女，碩士研究生；龍玲(1990—)，女，碩士研究生，此作者為共同第一作者；朱乃碩，男，教授，通訊聯系人，E-mail： nzhu@fudan.edu.cn.

Q 93-3

A