高效液相色譜法檢測蜂蜜中大米糖漿摻假

張其安楊少波王坤丁曉敏盧德梅（山東華康蜂業(yè)有限公司，日照76500；山東華瀚食品有限公司，日照7686；咸陽健康蜂業(yè)有限公司，咸陽7400）

高效液相色譜法檢測蜂蜜中大米糖漿摻假

張其安1楊少波1王坤2丁曉敏2盧德梅3
（1山東華康蜂業(yè)有限公司，日照276500；2山東華瀚食品有限公司，日照276826；3咸陽健康蜂業(yè)有限公司，咸陽713400）

建立了反相色譜快速測定蜂蜜中大米糖漿含量的分析方法。蜂蜜樣品用水溶解后，直接上樣至C18固相萃取柱凈化，甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)濃縮、溶解、過濾后進行HPLC分析。采用Sinochrom ODS-BP柱，以水+乙腈=93+7為流動相，紫外檢測波長300nm，外標法定量。結(jié)果表明，蜂蜜中大米糖漿摻假檢出限（LOD）為20mg/m l，在50～200mg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r≥0.9986；在線性范圍內(nèi)的添加水平平均回收率為82.7～96.3%，相對標準偏差（RSD）≤5.5%。該方法具有良好的精密度和重現(xiàn)性，適用于蜂蜜中大米糖漿摻假的檢測。

高效液相色譜；紫外檢測器；蜂蜜摻假；大米糖漿

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水貯存至成熟而成的天然甜物質(zhì)[1-2]。蜂蜜中含有多種活性物質(zhì)，其主要成分為果糖和葡萄糖及4～5%的低聚果糖，另外蜂蜜中還含有豐富的氨基酸、維生素、活性酶、類黃酮、多酚類、類胡蘿卜素等活性物質(zhì)及多種礦物質(zhì)[3]，蜂蜜既具有極高的營養(yǎng)價值又具有保健作用[4]。我國是養(yǎng)蜂及蜂蜜出口大國，20世紀90年代我國蜂蜜出口量占世界年貿(mào)易量的40%。然而，蜂蜜是一種極易摻假的食品，近年來由于摻假等質(zhì)量問題，使我國蜂蜜產(chǎn)品的信譽越來越低，出口量逐年下降[5]。為了規(guī)范蜂蜜市場，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標準化委員會于2005年10月26日發(fā)布了GB18796－2005《蜂蜜》國家強制性標準，規(guī)定蜂蜜中不得添加或混入任何淀粉類、糖類、代糖類物質(zhì)；不得在蜂蜜中添加其他任何防腐劑、澄清劑、增稠劑等異物。

目前針對蜂蜜摻假的檢測方法主要有：薄層色譜法[6]、差示掃描熱量法（DSC）[7]、離子色譜法[8]、近紅外光譜法[9-10]、傅里葉轉(zhuǎn)換－拉曼光譜法（FT－Ihman）[11]、C4植物糖含量法[12]，13C/12C同位素比值法[13]、天然同位素核磁共振法（SNIF-NMR）[14-16]等。以上方法都是基于對蜂蜜和摻假蜂蜜中糖分的檢測比較，只能對蜂蜜中摻入的蔗糖、高果糖漿、C4植物轉(zhuǎn)化糖等成分進行檢測，而且對試劑、進樣樣品要求較高，樣品前處理步驟要求嚴格，儀器、設備昂貴。大米糖漿主要成分為果糖和葡萄糖，屬于C3植物糖，是由大米淀粉經(jīng)化學和生物方法轉(zhuǎn)化后，再經(jīng)過凈化處理得到的，大米糖漿在糖的組成及同位素比值方面與蜂蜜極為相似。因此以上現(xiàn)行的國家標準和檢測方法很難對其進行鑒別檢測。本研究比較了大米糖漿和蜂蜜中紫外吸收物質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)了一種大米糖漿中特有的紫外吸收物質(zhì)，通過高效液相色譜-紫外檢測法檢測該物質(zhì)，能精確的檢測蜂蜜中是否摻有大米糖漿。該方法具有快速、準確、靈敏等特點，并且能降低企業(yè)的檢測成本，易于在蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)普及，指導其生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

蜂蜜樣品采自于山東華康蜂業(yè)有限公司合作社蜂場；大米糖漿購自于蕪湖秦氏糖業(yè)有限公司。

甲醇、乙腈(均為色譜純)天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；水為超純水。

LC-10AVP Plus高效液相色譜儀(配有SPD-10AVP紫外檢測器、DGU-20A3在線脫氣機、LC-20ATXL泵、CTO-10ASVP柱溫箱、手動進樣器、LC-Solution數(shù)據(jù)處理軟件)和SHIMADZU AUY220型分析天平日本島津公司；

756PC紫外可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1 HPLC檢測波長的選擇

準確稱取蜂蜜以及大米糖漿0.5g，分別置于10 ml容量瓶，加去離子水定容至刻度，混勻，超聲溶解30 min，3000 r/min離心5 min，然后取2 ml于石英比色皿內(nèi)進行紫外光譜掃描，以水作空白對照。

1.2.2大米糖漿標準工作液的配制

準確稱取適量的大米糖漿，分別用基質(zhì)空白溶液配制成質(zhì)量濃度為5～200mg/ml的標準工作液，以0.45μm微孔濾膜過濾后，準備HPLC分析。

1.2.3樣品的制備

準確稱取0.5g蜂蜜樣品，置于10m l容量瓶，加去離子水定容至刻度，混勻，超聲溶解30min。取1ml過預先依次用3m l甲醇、6ml水活化好的C18固相萃取柱，3mL水洗C18柱，棄去流出液。在65kPa的壓力下抽干60min。然后用3ml甲醇洗脫，收集洗脫液于60℃下氮氣吹干，1m l水溶解，渦旋振蕩器振蕩混勻1min，以0.45μm微孔濾膜過濾后，準備HPLC分析。

1.2.4色譜條件的選擇

將1.2.2中大米糖漿標準液及1.2.3中蜂蜜樣品以0.45μm微孔濾膜過濾后，進行HPLC分析。色譜條件如下：檢測波長300nm，流速0.80m l/min，柱溫30℃，進樣量100μl。分別考察了Sinochrom ODS-BP柱(250mm× 4.6mm，5μm)、SHIMADZU VP-ODS C18柱(250mm× 4.6mm，5μm)，以及不同的流動相對大米糖漿及蜂蜜樣品中紫外吸收物質(zhì)的分離情況，選擇分離度較好的色譜柱和流動相作為分析HPLC流動相條件。

2　結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測波長的選擇

蜂蜜樣品和大米糖漿紫外掃描圖譜1所示，可以看出，蜂蜜樣品和大米糖漿最大吸收均出現(xiàn)在220nm左右，在此波長下對大米糖漿進行檢測可能會受到蜂蜜中基質(zhì)的干擾。同時，大米糖漿在280nm附近也有一吸收峰，而蜂蜜則在260nm附近有一吸收峰。因此，選擇300nm為檢測波長，能夠?qū)Υ竺滋菨{進行檢測，并且能夠減少蜂蜜中基質(zhì)的干擾，以后的試驗也驗證了300nm處檢測靈敏度最高。

圖1　大米糖漿和蜂蜜樣品紫外掃描圖譜

2.2樣品凈化條件的選擇

蜂蜜基質(zhì)比較復雜，對蜂蜜中大米糖漿的檢測造成干擾，因此測定前需對樣品進行凈化處理。試驗對Sep-pak C18、OASIS HLB、OASIS MCX三種固相萃取柱的萃取效率進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在OASIS MCX柱洗脫液中沒有檢測到大米糖漿，OASIS HLB柱和Seppak C18柱對大米糖漿回收率分別為88.6%和86.7%。綜合考慮，本方法選擇Sep-pak C18柱為凈化柱。

試驗發(fā)現(xiàn)，氮氣吹干過程中，在45～80℃范圍內(nèi)溫度與吹干時間成反比，且對大米糖漿中的紫外吸收物質(zhì)的回收率沒有明顯的影響。但是溫度過高容易在氮吹儀的玻璃蓋上形成水滴，綜合考慮，本試驗選擇60℃為濃縮溫度。

2.3色譜條件的選擇

試驗中考察了Sinochrom ODS-BP柱(250mm× 4.6mm，5μm)、SHIMADZU VP-ODS C18柱(250mm× 4.6mm，5μm)為分離色譜柱對大米糖漿中紫外吸收物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明，大米糖漿紫外吸收物質(zhì)在Sinochrom ODS-BP柱中能獲得較好的分離。Sinochrom ODS-BP柱填料經(jīng)過技術(shù)改良，增加了在其它C18柱上不保留或者保留較弱的極性化合物和親水性化合物的選擇性，即使在以純水作為流動相的條件下也可以使用，進一步驗證了大米糖漿中的紫外吸收物質(zhì)可能為極性化合物或親水性化合物。所以本試驗選擇Sinochrom ODS-BP柱為該方法的分離色譜柱。

圖2　水+乙腈=95+5作為流動相時大米糖漿(A)和蜂蜜樣品(B)色譜圖

考慮到大米糖漿中紫外吸收物質(zhì)可能為親水性化合物，極性較強，因此最初選擇水+乙腈=95+5作為流動相，對大米糖漿和蜂蜜樣品進行分析，色譜圖見圖2。可以看出，大米糖漿在此時間之后出現(xiàn)兩個色譜峰，保留時間分別12.48min、13.57min；蜂蜜樣品在12.48min未檢測到色譜峰，只有保留時間為13.57的一個色譜峰。因此，可以確定保留時間為12.48min色譜峰所代表的組份為大米糖漿特征物質(zhì)。

由圖2（A）可以看出，保留時間分別為12.48min、13.51min的兩個色譜峰的分離度不好，影響對大米糖漿的準確定量。為改善分離度，試驗增大流動相中有機相的比例，以水+乙腈=93+7作為流動相，對大米糖漿和蜂蜜樣品進行分析，色譜圖見圖3?？梢钥闯?，該流動相對大米糖漿中兩種組份有較好的分離，且峰形對稱，可以滿足對大米糖漿定量的要求。

圖3　水+乙腈=93+7作為流動相時大米糖漿(A)和蜂蜜樣品(B)色譜圖

2.4線性范圍與檢出限

將大米糖漿用基質(zhì)空白溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度的標準工作液，按上述優(yōu)化好的條件測定，進樣量為100μL，以大米糖漿的質(zhì)量濃度為橫坐標、大米糖漿特征物質(zhì)（RT=9.78min）的峰面積為縱坐標作線性回歸。結(jié)果表明，大米糖漿在50～200mg/g范圍內(nèi)響應值在儀器線性范圍之內(nèi)，且線性關(guān)系良好。回歸方程為Y= 53.2245X+7.3541，相關(guān)系數(shù)r=0.9986。

根據(jù)最終樣品所代表試樣的質(zhì)量、定容體積、進樣量等情況，以S/N＞3為原則，確定本方法對大米糖漿的檢出限為20 mg/g。

2.5方法的回收率與精密度

用不含大米糖漿的蜂蜜樣品進行添加回收和精密度試驗。蜂蜜樣品中分別添加50 mg/g、100 mg/g、150 mg/g、200 mg/g的大米糖漿，充分震蕩混勻，按照本方法進行凈化及分析，其回收率和精密度見表1。

表1　方法加標回收率和精密度實驗(%)

從表1中的回收率和精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法回收率全部數(shù)據(jù)在82.7～96.3%之間，室內(nèi)四個水平的標準偏差≤5.5%，說明方法的回收率和精密度良好，可以滿足對蜂蜜中大米糖漿摻假的檢測要求。

3　討論

本方法首先通過紫外光譜掃描獲得大米糖漿中紫外吸收物質(zhì)的吸收波長；然后在此波長下通過HPLC對這些紫外吸收物質(zhì)進行分離，獲得大米糖漿特征物質(zhì)的色譜峰信息；再通過大米糖漿特征物質(zhì)色譜峰對大米糖漿進行定量測定。用該方法檢測蜂蜜中的大米糖漿摻假，方法準確可靠、重復性好、靈敏度高，適用于實驗室日常大批量的樣品檢測。但是本試驗僅獲得大米糖漿特征物質(zhì)的色譜信息，對其組成、結(jié)構(gòu)等信息尚未獲取，今后的試驗將借助LC-MS、NMR等手段對大米糖漿特征物質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)進行分析，以期能更精確的檢測蜂蜜中大米糖漿摻假。

蜂蜜是一種極易摻假的食品，僅僅通過一種或幾種方法很難做到對其品質(zhì)和真?zhèn)稳娴呐卸?。尤其是近幾年來隨著蜂蜜造假原料越來越精細化、多樣化，造假技術(shù)越來越專業(yè)化，僅靠檢測其中的幾種指標已經(jīng)遠遠不能滿足對其品質(zhì)和真?zhèn)巫龀雠卸ǖ囊?。運用包括同位素分析法、色譜法、光譜法（紅外光譜分析及核磁共振分析）、電化學分析法，針對蜂蜜中某些活性成分的生物分析法（蛋白印跡法、免疫法）以及基于遺傳基因的實時熒光定量PCR法等相結(jié)合，建立多元化的檢測指標，這將是今后蜂蜜品質(zhì)控制的發(fā)展方向。

[1]olaitan P B,adeleke O E,ola I O.Honey:a reservoir for microorganisms and an inhibitory agent for microbes[J].African Health Sciences,2007,7(3):159-165.

[2]中國國家標準化管理委員會.GB 18796—2005蜜蜂[S].北京:中國標準出版社,2005.

[3]ezz el-arab A M,girgis S M,hegazy E M,et al.Effect of dietary honey on intestinal microflora and toxicity of mycotoxins in mice[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine,2006,6(1):6.

[4]Arvanitoyannis IS,Chalhoub C,Gotsiou P,et al.Novel quality control methods in conjunction with chemometrics(multivariate analysis)for detecting honey authenticity[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2005, 45(3):193-203.

[5]朱青,王畢妮,梁艷,等.蜂蜜摻假檢測方法的研究進展[J].中國蜂業(yè),2008,59(10):35-37.

[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB 18932.2—2002蜜蜂中高果糖淀粉糖漿測定方法薄層色譜法[S].北京:中國標準出版社,2005.

[7]黃文誠編譯.差示掃描熱量法（DSC）是檢測蜂蜜摻假的一項新技術(shù)[M].中國蜂業(yè),2007,58(9):33.

[8]Cordella C,Militao J,Clement M,Drajnudel P,et al.Detection and quantification of honey adulteration via direct incorporation of sugar syrups or bee-feeding:preliminary study using high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAECPAD)and chemometrics[J].Analytica Chimica Acta,2005, 531,239-248.

[9]屠振華,籍保平,孟超英,等.近紅外光譜法測定蜂蜜中主要成分的可行性研究[J].光譜學與光譜分析,2009,29(12):3291-3294. [10]J.F.Daniel Kelly,Gerard Downey,Vanessa Fouratier.Initial Study of Honey Adulteration by Sugar Solutions Using Mid-infrared (MIR)Spectroscopy and Chemometrics[J].J Agric Food Chem,2004, 52(1):33-39.

[11]Paradkar M,Irudayaraj J.Discrimination and classification of beet and cane inverts in honey by FT-Raman spectroscopy[J].J Agric Food Chem,2001,76:231-239.

[12]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB 18932.1—2002蜜蜂中碳-4植物糖含量測定方法穩(wěn)定同位素比率法[S].北京:中國標準出版社,2005.

[13]Padovana G.J,De Jongb D,Rodriguesa L P,et al.Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C isotopic ratio[J].J Agric Food Chem,2003,82(4):633-636.

[14]Martin G.J,Martin.M L.Deuterium labeling at the natural abundance level as studied by high field quantitative 2H NMR[J].Tetrahedron Lett,1981,22(36),3525-3528.

[15]閻政禮,楊明生,李添寶,等.蜂蜜中葡萄糖、果糖、和蔗糖NMR定量分析研究[J].食品科學,2009,30(14):253-255.

[16]Arvanitoyannis I S,Chalhoub C,Gotsiou P,et al.Novel quality control methods in conjunction with chemo metrics(multivariate analysis)for detecting honey authenticity[J].Crit Rev Food Sci Nutr, 2005,45(3):193-203.

Determination of honey adulteration by addition of rice syrup using HPLC

Zhang QiAn1Yang Shaobo1Wang Kun2Ding Xiaomin2Lu Demei3
（1 Shandong Huakang Honey Products Co.,Ltd,Rizhao 276500；2.Shandong Huahan Foods Co.,Ltd, Rizhao 276826；3.Xianyang Jiankang Honey Products Co.,Ltd,Xianyang 713400）

A reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the rapid determination of honey adulteration by addition of rice syrup.The honey sample was dissolved in water and the solution was cleaned with a C18 SPE cartridge.The cartridge was eluted with methanol.The solution was concentrated and then analyzed by HPLC. The HPLC conditions were as follows:Sinochrom ODS-BP column was used with water+acetonitrile=93+7 as the mobile phase,and detection with ultraviolet detector and ration with external standard.The results showed that the detection limit of rice syrup was 20mg/m l.Linear range was 50mg/g～200mg/g.Within its linear,ranger≥0.9986 and the recoveris were between 82.7%and 96.3%,RSD≤5.5%.This method,due to its sensitivity and reliability,has good suitability for determination of honey adulteration by addition of rice syrup.

high-performance liquid chromatographic;ultraviolet detector;honey adulteration;rice syrup

張其安(1966－)，男，本科，研究方向為蜂產(chǎn)品加工與檢測，E-mail：sdhkfy@126.com。

楊少波(1978－)，男，碩士，研究方向為蜂產(chǎn)品加工與檢測，E-mail：hkhoney@126.com。