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      中國野生葡萄葉綠體分離及葉綠體DNA提取的研究

      2016-09-02 08:02:10謝海坤樊秀彩姜建福孫海生劉崇懷
      西北植物學(xué)報(bào) 2016年7期
      關(guān)鍵詞:柱式葉綠體預(yù)冷

      謝海坤,焦 健,樊秀彩,張 穎,姜建福,孫海生,劉崇懷

      (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,鄭州450009)

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      中國野生葡萄葉綠體分離及葉綠體DNA提取的研究

      謝海坤,焦健,樊秀彩,張穎,姜建福,孫海生,劉崇懷*

      (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所,鄭州450009)

      以中國野生刺葡萄、山葡萄、桑葉葡萄和東南葡萄的成熟葉片為材料,比較柱式植物葉綠體DNAout試劑盒和改良的高鹽-低pH法分離葉綠體及提取cpDNA效果。結(jié)果顯示:(1)2種方法均分離得到了中國野生葡萄的葉綠體,但與柱式植物葉綠體DNAout試劑盒相比,改良的高鹽-低pH法得到的葉綠體濃度高、雜質(zhì)少,更適合中國野生葡萄葉綠體分離。(2)柱式植物葉綠體DNAout試劑盒提取的cpDNA,其OD260/OD280在1.28~1.36之間,質(zhì)量濃度為4.2~7.8 ng·μL-1,質(zhì)量低,不能滿足后續(xù)測(cè)序要求;而改良的高鹽-低pH法提取的cpDNA,其OD260/OD280值在1.84~1.90之間,質(zhì)量濃度為2 514.4~4 133.7 ng·μL-1,質(zhì)量高,純度好,能滿足后續(xù)測(cè)序要求。研究表明,改良的高鹽-低pH法能簡便、快速獲得中國野生葡萄完整葉綠體及高質(zhì)量cpDNA,并且提取的cpDNA可滿足后續(xù)測(cè)序要求,為葡萄屬植物葉綠體基因組的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

      中國野生葡萄;葉綠體分離;cpDNA提?。恢街参锶~綠體DNAout;改良的高鹽-低pH法

      葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器,具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)(cpDNA)。cpDNA一般長120 160 kb[1],多數(shù)是共價(jià)閉合雙鏈分子,少數(shù)為線狀分子。葉綠體基因組由4部分組成,大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和2個(gè)反向重復(fù)序列(IRs)。葉綠體基因組序列高度保守,且屬于母系遺傳,后代遺傳穩(wěn)定,已在遺傳結(jié)構(gòu)分析[2]、分子標(biāo)記[3]、核質(zhì)互作和葉綠體基因工程[4]、起源演化[5]等領(lǐng)域開展了廣泛研究。

      常用的植物葉綠體的分離及cpDNA提取的方法主要有DNaseI法[6]、無水法[7]、蔗糖密度梯度離心法[8]、Percoll密度梯度離心法[9]、氯化銫密度梯度離心法[10]和改良的高鹽-低pH法[11]。DNaseI法難以使葉綠體膜保持完整,導(dǎo)致cpDNA的得率很低[11]。無水法的報(bào)道相對(duì)較少,目前只應(yīng)用在C4植物黍子[12]等植物葉綠體的分離上。傳統(tǒng)的密度梯度離心法主要用于提取豆科和禾本科植物的cpDNA,其成本高、耗時(shí)長、產(chǎn)率低,對(duì)設(shè)備要求也較高,不宜廣泛應(yīng)用[13]。而改良的高鹽-低pH法,可以簡單、快速獲得完整葉綠體和高質(zhì)量cpDNA,目前已成功在楊樹[14]、雷蒙德氏棉[15]、小麥[16]、茶樹[17]、棗[18]、割手密[19]等植物中得到驗(yàn)證。

      野生葡萄葉片內(nèi)富含色素和單寧類物質(zhì),在采用常規(guī)的植物葉綠體分離及cpDNA提取方法時(shí),會(huì)產(chǎn)生大量泡沫或沉淀,影響分離及提取效果。1994年,吳俊輝等[20]采用蔗糖密度梯度離心法,對(duì)幾種中國野生葡萄的葉綠體進(jìn)行了研究,克服了色素和單寧等對(duì)葉綠體分離的影響,成功提取和純化了葉綠體及其DNA。但是,此方法耗時(shí)長、操作繁瑣、對(duì)設(shè)備要求也高,不易廣泛應(yīng)用。而改良的高鹽-低pH法[11]結(jié)合了蔗糖密度梯度離心法、DNaseI法和鹽沉淀法的優(yōu)點(diǎn),結(jié)果表明,它可以簡便、快速地獲得完整葉綠體及高質(zhì)量cpDNA,已廣泛應(yīng)用在其他被子植物中。本研究將此方法應(yīng)用于中國野生葡萄葉綠體分離及cpDNA提取,同時(shí)與柱式植物葉綠體DNAout試劑盒提取方法比較,探尋一個(gè)簡便、快速獲得中國野生葡萄完整葉綠體及高質(zhì)量cpDNA的方法,為葡萄屬植物葉綠體的分離及其DNA的提取提供方法指導(dǎo),這對(duì)葡萄屬植物葉綠體基因組的深入研究有重大意義。

      1 材料和方法

      1.1實(shí)驗(yàn)材料

      中國野生刺葡萄(Vitisdavidii)、山葡萄(V.amurensis)、桑葉葡萄(V.heyneana)和東南葡萄(V.chunganensis)的成熟葉片采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家果樹種質(zhì),鄭州葡萄圃。2015年5月摘取成熟健康的葡萄葉片,帶回實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)蒸餾水洗凈,用濾紙吸干水分,并用濕潤的紗布包裹。處理后的葉片于4 ℃冰箱黑暗處饑餓處理24 h,然后液氮速凍處理,存于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2方法

      1.2.1葉綠體的分離和cpDNA提取柱式植物葉綠體DNAout試劑盒(CAT#: 120406-15)購自北京天恩澤基因科技有限公司,所有步驟均按照此試劑盒的使用說明書操作。

      改良高鹽-低pH法參考Shi等[11]的方法,略調(diào)整。所有操作均在冰上進(jìn)行,所用玻璃器皿要事先預(yù)冷。

      葉綠體的分離步驟如下:

      (1)勻漿:取饑餓處理的中國野生葡萄葉片20 g,去粗葉脈,剪成1 cm長短,裝入預(yù)冷的九陽料理機(jī)(JYL-C012)中,迅速加入預(yù)冷的Buffer A[(1.25 mol/L NaCl,0.25 mol/L抗壞血酸,10 mmol/L焦亞硫酸鈉,0.012 5 mol/L 硼砂,50mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),7 mmol/L Na2EDTA(pH 8.0),1% PVP-K40即聚乙烯吡咯烷酮(w/v),0.1%BSA即牛血清蛋白(w/v),1 mmol/L DTT即二硫蘇糖醇(BSA和DTT現(xiàn)用現(xiàn)加,pH 3.8)]400 mL,勻漿過程盡量避免發(fā)熱,先低速勻漿2次,每次5 s,后高速勻漿57次,每次10 s,最終使材料勻漿完全。

      (2)過濾:用200目單層尼龍網(wǎng)過濾勻漿液至預(yù)冷的500 mL量筒中,再等分到6個(gè)預(yù)冷的50 mL塑料離心管中,靜置2 min。

      (3)棄細(xì)胞殘?。? ℃、180 g(原文獻(xiàn)中200 g),離心20 min,取上清;重復(fù)離心1次。

      (4)粗提:4 ℃、3 070 g(原文獻(xiàn)中3 500 g),離心20 min,棄上清。

      (5)純化:每管沉淀中加入42 mL預(yù)冷的Buffer B[1.25 mol/L NaCl,0.012 5 mol/L硼砂,1% PVP-K40(w/v),50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),25 mmol/L Na2EDTA (pH 8.0),0.1%BSA(w/v),1mmol/L DTT(BSA和DTT現(xiàn)用現(xiàn)加),pH 8.0],用大小適中的無菌軟毛刷輕輕洗刷,使沉淀充分懸??;4 ℃、3 070 g(原文獻(xiàn)中3 500 g),離心20 min,棄上清。

      (6)再純化:再次向每管沉淀中加入42 mL Buffer B,用無菌軟毛刷使沉淀輕輕懸浮,4 ℃、3 300 g,離心20 min,棄上清。管中即為所得葉綠體沉淀,此步驟是新增的。

      (7)重復(fù)上步操作1次。隨后,用顯微鏡觀察葉綠體的完整性。

      葉綠體的裂解和cpDNA提取步驟如下:在6管純化的葉綠體沉淀中均加入2 mL Buffer B,并合為一管,在4 ℃、3 300 g(原文獻(xiàn)中3 750 g),離心20 min,棄上清。再向葉綠體沉淀中加入8 mL Buffer C[100 mmol/L NaCl,100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),50 mmol/L Na2EDTA,1 mmol/L DTT(DTT現(xiàn)用現(xiàn)加)]、1.5 mL 20% SDS、20 μL β-巰基乙醇、30 μL蛋白酶K(10 mg/mL),充分混勻,55 ℃水浴鍋中培養(yǎng)過夜,使葉綠體充分裂解,釋放出cpDNA。

      裂解結(jié)束后,將裂解液冰浴5 min,后加入1.5 mL KAc(pH 5.7),顛倒混勻,再冰浴30 min;4℃、5 260 g(原文獻(xiàn)中10 000 g),離心15 min,用移液槍吸上清。加入與上清等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提2次,每次需充分顛倒混勻,4 ℃、5 260 g(原文獻(xiàn)中10 000 g),離心20 min。離心后的液體包括上層水相、中層變性蛋白和下層的有機(jī)溶劑。小心移取上清液至新的50 mL離心管中,加入等體積預(yù)冷的異丙醇,輕輕顛倒混勻,-20 ℃過夜沉淀cpDNA。

      4 ℃、5 260 g(原文獻(xiàn)中10 000 g),離心20 min,棄上清,得到cpDNA。用彎鉤針頭將沉淀挑出,置于2 mL離心管中。cpDNA用預(yù)冷的70%乙醇、無水乙醇洗滌。自然風(fēng)干沉淀,加入50 μL 1×TE Buffer(pH 8.0),4 ℃溶解過夜,輕輕混勻后,即得到cpDNA原液。

      加0.5 μL RNase A(去Dnase,10 mg/mL)處理cpDNA原液,37 ℃溫育30 min,自然冷卻后,得到cpDNA溶液,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2葉綠體顯微觀察取2 mL Buffer B溶液加入提取的葉綠體沉淀中,制作臨時(shí)裝片,在尼康顯微鏡(ECLIPSE Ti-S/L100型)100×油鏡下觀察葉綠體的狀況。

      1.2.3中國野生葡萄cpDNA質(zhì)量檢測(cè)從提取的cpDNA溶液中取2 μL,在核酸蛋白檢測(cè)儀(美國Thermo公司,ND-1000型)上測(cè)定核酸含量,用1×TE Buffer(pH 8.0)作空白對(duì)照,記錄OD260/OD280、OD260/OD230及質(zhì)量濃度。

      1.2.4中國野生葡萄cpDNA電泳檢測(cè)取2 μL cpDNA溶液,加2 μL稀釋10×的熒光染料和1 μL 6×loading buffer(上樣緩沖液)混勻,在0.7%(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳,電泳緩沖液為1×TAE,恒壓126 V,恒流120 mA,電泳大約60 min后,在紫外凝膠成像分析儀(Carestream公司,GL212PRO型)下檢測(cè)其條帶情況,并拍照。

      2 結(jié)果與分析

      2.1中國野生葡萄葉綠體顯微觀察

      采用柱式植物葉綠體DNAout(方法Ⅰ)和改良高鹽-低pH法(方法Ⅱ),分別分離得到了刺葡萄、山葡萄、桑葉葡萄和東南葡萄的葉綠體(圖1)。對(duì)比發(fā)現(xiàn),方法Ⅱ得到的葉綠體濃度高、數(shù)量多、雜質(zhì)少、背景清晰,更適宜中國野生葡萄葉綠體的分離。

      2.2中國野生葡萄cpDNA質(zhì)量檢測(cè)

      從中國野生葡萄cpDNA的OD260/OD280、OD260/OD230和質(zhì)量濃度參數(shù)(表1)可以看出,2種方法得到的cpDNA各種指標(biāo)差異顯著。方法I提取的cpDNA質(zhì)量濃度在4.2~7.8 ng·μL-1之間,OD260/OD280值在1.28~1.36之間,低于純凈DNA的比值1.8~2.0,而OD260/OD230值在0.44~0.67之間,低于污染物的評(píng)估值2.0,這表明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)、酚類及多糖,cpDNA斷裂嚴(yán)重,純度很低,不能滿足后續(xù)的建庫測(cè)序要求。而方法Ⅱ提取的cpDNA,質(zhì)量濃度高達(dá)2 514.4~4 133.7 ng·μL-1,OD260/OD280值在1.84~1.90之間,居純凈DNA的比值1.8~2.0之間,OD260/OD230值為在2.07~2.14之間,大于污染物的評(píng)估值2.0,說明多糖、蛋白質(zhì)、碳水化合物的污染輕,可以滿足建庫測(cè)序要求。因此,方法Ⅱ提取的中國野生葡萄cpDNA的各種指標(biāo)顯著高于方法Ⅰ。由上述可知,改良的高鹽-低pH方法所提取的cpDNA更能滿足測(cè)序要求,此方法更適合葡萄屬植物cpDNA提取。

      圖1 柱式植物葉綠體DNAout(Ⅰ)和改良高鹽-低pH法(Ⅱ)分離幾種野生葡萄葉綠體顯微圖片F(xiàn)ig. 1 Chloroplast micrographs of 4 grapes species seperated by column plant chloroplast DNAout(Ⅰ)and modified high-salt low-pH method(Ⅱ)

      2.3中國野生葡萄cpDNA電泳檢測(cè)

      從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)可以看出:方法I提取的cpDNA無條帶,而方法Ⅱ提取的cpDNA主帶清晰、明亮、整齊一致,無降解現(xiàn)象,且無RNA、多糖及其他次生物等雜質(zhì)的干擾。對(duì)比可知,方法Ⅱ所得cpDNA的質(zhì)量顯著好于方法Ⅰ,與核酸蛋白檢測(cè)儀分析結(jié)果相一致。

      3 討 論

      高質(zhì)量cpDNA是葉綠體基因組測(cè)序的基礎(chǔ)。相對(duì)于全基因組DNA的提取,cpDNA的提取難度更大,因?yàn)槿~綠體的分離較為困難,并且存在核DNA和線粒體DNA的污染。要提取高質(zhì)量的cpDNA,首先要分離得到完整的葉綠體,并進(jìn)行純化。此外,葉綠體的裂解和cpDNA 的提取也需要精細(xì)操作。

      表1 2種方法提取的cpDNA紫外分析結(jié)果

      注:Ⅰ、Ⅱ分別對(duì)應(yīng)柱式植物葉綠體DNAout和改良的高鹽-低pH方法

      Note: Ⅰ and Ⅱ stand for the column plant chloroplast DNAout and the modified high-salt low-pH method

      圖2 柱式植物葉綠體DNAout(Ⅰ)和高鹽-低pH法(Ⅱ)提取幾種葡萄cpDNA電泳圖譜Fig. 2 Electrophoresis pattern of cpDNA of 4 grapesextracted by column plant chloroplast DNAout(Ⅰ)and modified high-salt low-pH method(Ⅱ)

      目前市場(chǎng)上還沒有針對(duì)分離葡萄葉綠體及提取其DNA的試劑盒,本實(shí)驗(yàn)所用的柱式植物葉綠體DNAout試劑盒主要是針對(duì)大豆、菠菜、煙草等一年生草本植物。從提取結(jié)果上看柱式植物葉綠體DNAout試劑盒不適合中國野生葡萄葉綠體的分離和cpDNA的提取,而改良的高鹽-低pH法卻能簡便、

      快速獲得中國野生葡萄完整葉綠體及高質(zhì)量葉綠體cpDNA。這可能是因?yàn)楦牧嫉母啕}-低pH法的緩沖液中,不僅含有大量的NaCl,使細(xì)胞和葉綠體膜有充足的韌性經(jīng)受離心、洗滌等操作,而且緩沖液中的維生素C、焦亞硫酸鈉、BSA和DTT等還原劑能抑制溶液中的游離氧化單寧和其它次生物質(zhì)呈顯色反應(yīng),從而維持勻漿液最初的顏色[20]。此緩沖液還能抑制核DNA與葉綠體之間的吸附,從而減少核DNA的污染[21]。此外,采摘葉片后的黑暗饑餓處理,充分消耗了葉片中的淀粉,減少了其對(duì)葉綠體分離和cpDNA提取的干擾[18]。

      本研究在改良的高鹽-低pH法的基礎(chǔ)上,對(duì)離心轉(zhuǎn)速和相關(guān)步驟略微調(diào)整,成功分離出中國野生刺葡萄、山葡萄、桑葉葡萄和東南葡萄的完整葉綠體,并提取得到高質(zhì)量cpDNA。改良的高鹽-低pH法分離出中國野生葡萄的葉綠體及提取的cpDNA顯著好于柱式植物葉綠體DNAout試劑盒所分離的葉綠體及提取的cpDNA,其OD260/OD280值在1.84~1.90之間,質(zhì)量濃度為2 514.4~4 133.7 ng·μL-1,質(zhì)量高,純度好,RNA消化完全,無降解現(xiàn)象,能滿足后續(xù)測(cè)序要求,為葡萄屬植物葉綠體基因組的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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      (編輯:宋亞珍)

      An Optimized Chloroplast Isolation and Chloroplast DNA Extraction Protocol for Chinese Wild Grapes

      XIE Haikun, JIAO Jian, FAN Xiucai, ZHANG Ying, JIANG Jianfu,SUN Haisheng, LIU Chonghuai*

      (Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009, China)

      Mature leaves collected fromVitisdavidii,V.amurensis,V.heyneanaandV.chunganensiswere used for chloroplast isolation and cpDNA extraction in this study. The two methods were the column plant chloroplast DNAout and modified high-salt low-pH method, and the results were compared with each other. (1) Both methods had separated the chloroplast of Chinese wild grapes, but the modified high-salt low-pH method obtained higher concentration and less impurity of chloroplast than that of column plant chloroplast DNAout. So the modified high-salt low-pH method was more suitable for chloroplast isolation. (2) The value of OD260/OD280of cpDNA extracted by the column plant chloroplast DNAout was between 1.28 and 1.36, and the concentration was between 4.2 ng·μL-1and 7.8 ng·μL-1, which did not meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. In contrast, the value of OD260/OD280of cpDNA extracted by the modified high-salt low-pH method was between 1.84 and 1.90 and the concentration was between 2 514.4 ng·μL-1and 4 133.7 ng·μL-1, so the cpDNA extracted in this way was extremely high-quality and pure. As a result, the cpDNA extracted by the modified high-salt low-pH method meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. As a conclusion, the modified high-salt low-pH method isolated intact chloroplast and extract high-quality cpDNA of Chinese wild grapes simply and quickly. And the cpDNA meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. It was also a critical step to make further research of chloroplast genomes ofVitisL.

      Chinese wild grapes; chloroplast isolation; cpDNA extraction; column plant chloroplast DNAout; modified high-salt low-pH method

      1000-4025(2016)07-1464-06

      10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1464

      2016-04-19;修改稿收到日期:2016-06-04

      現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-30-yz-1);中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI);農(nóng)業(yè)部物種保護(hù)項(xiàng)目(2130135-34)

      謝海坤(1989-),女, 在讀碩士生,主要從事葡萄種質(zhì)資源研究。E-mail:1379226793@qq.com

      劉崇懷,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事葡萄種質(zhì)資源研究。E-mail: liuchonghuai@caas.cn

      Q781; S663.1

      A

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