HPLC法測定不同產(chǎn)地五味子中5種成分的質(zhì)量比

王連芝，付　克，顧媛媛，劉　磊，張淑香，周　琦

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040)

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HPLC法測定不同產(chǎn)地五味子中5種成分的質(zhì)量比

王連芝，付克，顧媛媛，劉磊，張淑香，周琦

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040)

采用高效液相色譜法同時(shí)測定五味子中五種木脂素成分的質(zhì)量濃度，對不同產(chǎn)地五味子的木脂素類成分進(jìn)行分析.色譜條件如下：色譜柱Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-水梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm.結(jié)果表明，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的線性范圍分別為0.34～0.85 μg、0.17～0.34 μg、0.03～0.18 μg、0.14～0.48 μg和0.04～0.143 μg；平均加樣回收率分別為99.34%、99.59%、100.34%、100.29%、99.78%.本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC方法穩(wěn)定可靠、簡便易行，為完善五味子的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù).

五味子；木脂素；質(zhì)量比測定；高效液相色譜法

五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. 的干燥成熟果實(shí).其味酸、甘，性溫，具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸失眠等[1].作為傳統(tǒng)中藥材，五味子應(yīng)用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，記載曰：“本品益氣、咳逆上氣，勞傷贏瘦、補(bǔ)不足，強(qiáng)陰，益男子精”.五味子中含有多種化學(xué)成分，如木脂素、多糖、揮發(fā)油、有機(jī)酸、三萜、甾醇、香豆素、內(nèi)酯、蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿類、黃酮類、強(qiáng)心苷類等[2-4].其中，木脂素是其主要化學(xué)成分[5-6].因此，本實(shí)驗(yàn)對東北地區(qū)十個(gè)不同產(chǎn)地五味子藥材中木脂素類成分進(jìn)行了高效液相分析，為完善五味子的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù).

1　儀器與試藥

1.1儀器

Waters2695-2998型高效液相色譜儀，KQ-300VD型雙頻數(shù)控超聲清洗器，F(xiàn)A1104型電子分析天平.

1.2試藥

對照品五味子醇甲(110857-201412)、五味子甲素(110764-201111)、五味子乙素(110765-201311)購自中國食品藥品檢定研究院；對照品五味子醇乙(130509)、五味子丙素(130521)購自成都標(biāo)樣生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，五味子藥材采購于大興安嶺塔河、伊春鐵力透龍山、饒河?xùn)|安林場、海林山河林場、清河育林林場、吉林集安、寶清寶山林場、延邊汪清、丹東鳳城、雞西向陽，經(jīng)筆者鑒定為木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) 的干燥成熟果實(shí).

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫為35 ℃; 流動相為乙腈-水梯度洗脫，0～17 min，50%乙腈，17～25 min，50%～55%乙腈，25～30 min55%～75%乙腈，30～40 min75%～65%乙腈，40～45 min65%乙腈，45～55 min65%～100%乙腈，55～65 min100%乙腈.流速：1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL.在此色譜條件下，各色譜峰理論板數(shù)均不小于4 000，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子均符合要求.

2.2對照品溶液的制備

分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素對照品適量，加甲醇適量，制成五味子對照品儲備液，分別為五味子醇甲質(zhì)量濃度為1.065 mg/mL、五味子醇乙質(zhì)量濃度為0.34 mg/mL、五味子甲素質(zhì)量濃度為0.292 mg/mL、五味子乙素質(zhì)量濃度為1.38 mg/mL、五味子丙素質(zhì)量濃度為0.34 mg/mL.

2.3供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率600 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得.按上述色譜條件進(jìn)行測定，色譜圖見圖1、2.

圖1　五味子對照品色譜圖

圖2　五味子樣品色譜圖

2.4線性關(guān)系考察

取0.4 mL五味子醇甲對照品溶液定容于10 mL量瓶中，分別精確進(jìn)樣8、10、12、14、16、18、20 μL；取0.5 mL五味子醇乙對照品溶液定容于10 mL量瓶中，分別精確進(jìn)樣10、12、14、16、18、20 μL；取0.5 mL五味子甲素對照品溶液定容于10 mL量瓶中，分別精確進(jìn)樣2、4、6、8、10、12 μL；取0.5 mL五味子乙素對照品溶液定容于20 mL量瓶中，分別精確進(jìn)樣4、6、8、10、12、14 μL；取0.3 mL五味子丙素對照品溶液定容于10 mL量瓶中，分別精確進(jìn)樣4、6、8、10、12、14 μL；以對照品的峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，以對照品的量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.五味子醇甲在0.34～0.85 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y= 4.689 8×107X+0.007 506(r2=0.999 9)；五味子醇乙在0.17～0.34 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y= 7.2179×107X-0.002913(r2=0.9998)；五味子甲素在0.03～0.18 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y= 4.801 8×107X+0.001 147(r2=0.999 8)；五味子乙素在0.14～0.48 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y= 6.4306×107X+0.02603(r2=0.9999)；五味子丙素在0.04～0.143 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y= 1.037 1×106+0.016 74(r2=0.999 8).

2.5精密度試驗(yàn)

取五味子對照品混合溶液(質(zhì)量濃度分別為五味子醇甲0.055 mg/mL、五味子醇乙0.017 mg/mL、五味子甲素0.005 84 mg/mL、五味子乙素0.041 4 mg/mL、五味子丙素0.008 16 mg/mL)進(jìn)行高效液相分析，色譜條件同2.1項(xiàng)下方法,進(jìn)樣體積12 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積積分值，計(jì)算其RSD值分別為五味子醇甲0.44%、五味子醇乙0.57%、五味子甲素0.85%、五味子乙素1.26%、五味子丙素1.46%.表明儀器的精密度良好.

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取1號五味子藥材粉末6份，依2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，五味子醇甲的平均質(zhì)量比為6.335 2 mg/g，RSD值為1.235 4%(n=6)；五味子醇乙的平均質(zhì)量比為2.247 2 mg/g，RSD值為1.584 1%(n=6)；五味子甲素的平均質(zhì)量濃度為0.895 1 mg/g，RSD值為1.654 2%(n=6)；五味子乙素的平均質(zhì)量濃度為5.220 8 mg/g，RSD值為1.450 1%(n=6)；五味子丙素的平均質(zhì)量比為1.440 6 mg/g，RSD值為1.600 3%(n=6).表明該實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好.

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取五味子藥材細(xì)粉0.3g，依2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每隔4 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次，測定，RSD分別為五味子醇甲0.18%、五味子醇乙0.26%、五味子甲素1.34%、五味子乙素0.54%、五味子丙素0.68%.表明該樣品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取五味子藥材細(xì)粉6份，每份0.1 g，精密加入五味子混合對照品10 mL，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理，測定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果五味子醇甲為99.34%、五味子醇乙99.59%、五味子甲素100.34%、五味子乙素100.29%、五味子丙素99.78%.結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法的回收率較高.

2.9樣品測定

精密稱取10個(gè)不同產(chǎn)地的五味子藥材細(xì)粉0.3 g，按2.3項(xiàng)下方法處理樣品，進(jìn)行高效液相分析，測定結(jié)果見表1.

表1　10個(gè)不同產(chǎn)地五味子中五種木脂素質(zhì)量比測定結(jié)果

3　結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)過程中，考察了甲醇提取溶劑的不同質(zhì)量濃度，不同提取時(shí)間和溶劑用量，結(jié)果表明，甲醇超聲提取35 min，液料比55 mL/g，提取效率較高且方法簡便易行，可完全提取五味子藥材中的木脂素類成分[7].在實(shí)驗(yàn)過程中參考文獻(xiàn)[8-10]對色譜條件進(jìn)行了篩選，考察了甲醇-水、乙腈-水不同配比的梯度洗脫系統(tǒng)，最終確定乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)，在該色譜條件下，樣品中各被測成分的色譜峰能達(dá)到較好的基線分離，保留時(shí)間適中.

實(shí)驗(yàn)中測定了十個(gè)不同產(chǎn)地五味子中五種木脂素的質(zhì)量比.結(jié)果表明，清河育林林場產(chǎn)五味子質(zhì)量較好，其五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的質(zhì)量比都是最高的.2010年版《中國藥典》規(guī)定五味子醇甲不得少于0.4%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十個(gè)不同產(chǎn)地五味子中五味子醇甲的質(zhì)量濃度均符合藥典規(guī)定.

測定結(jié)果表中，不同產(chǎn)地五味子中各種木脂素類成分質(zhì)量比參差不齊，且各成分之間沒有關(guān)聯(lián)性，故建議進(jìn)行多個(gè)指標(biāo)成分的定量分析和增加總木脂素質(zhì)量比測定來控制五味子的質(zhì)量，更全面地反應(yīng)藥材的質(zhì)量.

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Quantitative analysis of five Lignans in Schisandra Chinensis from different habitats by HPLC

WANG Lian-zhi, FU Ke, GU Yuan-yuan, LIU Lei, ZHANG Shu-xiang, ZHOU Qi

(Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040, China)

To establish a method for determining five lignans in Schisandra chinensis by HPLC，and to study lignans composition of Schisandra chinensis from different habitats. The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm). Acetonitrile-water was used as gradient mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was maintained at 30 ℃ and the detection wavelength was set at 254 nm. Results indicated that the calibration curves of schisandrin, schisandrol B, deoxyschizandrin, r-schisandrin, schisandrin C were linear within the ranges of 0.34～0.85μg, 0.17～0.34μg, 0.03～0.18μg, 0.14～0.48μg and 0.04～0.143 μg, respectively. The average recoveries were 99.34%, 99.59%, 100.34%, 100.29%, 99.78%, respectively. The HPLC method was reliable and feasible, provided a basis for improvement of quality evaluation for Schisandra chinensis.

Schisandra chinensis; Lignans; content determination; HPLC

2015-07-10.

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目項(xiàng)目(12531628)

王連芝(1973-)，女，碩士，副研究員，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

R284

A

1672-0946(2016)04-0415-03