谷新怡，周　劍，趙朋波，劉愛偉，尚姍姍，閆曉玲，吳魯華，夏燕婷

?

·實驗論著·

橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)精確損傷模型

谷新怡1，周劍1，趙朋波1，劉愛偉1，尚姍姍2，閆曉玲1，吳魯華2，夏燕婷1

Foundation items:National Natural Science Foundation Project (No.81173307); Natural Science Foundation Project of Beijing (No.16G40086)

1Department of Ophthalmology, Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China;2Department of Ophthalmology, the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Correspondence to:Jian Zhou. Department of Ophthalmology, Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China.zhj9667@126.com

Abstract

?AIM: To make a rat model of optic nerve injury by using the transverse quantitative traction method, and to evaluate the survival rate of retinal ganglion cells (RGCs) of the model using the method of fluorogold retrograde labeling.

?METHODS:Twenty-five Wistar rats were randomly divided into five groups: sham operation group, 1d, 3d, 7d and 14d after tractive optic nerve injury group. The model groups pulled the left optic nerve with lateral tensiometer; the sham operation group only exposed the optic nerve but not pulled. The right eyes of each group were served as normal control eyes. The RGCs density of the five groups was observed by fluorogold retrograde labeling.

?RESULTS:In the normal control group, the RGCs labeled by the fluorescent gold were round or oval, clear boundary, no obvious fluorescent dye leakage and partially visible cell processes. However, in the optic nerve traction groups, the number of RGCs decreased with time increasing and the cell distribution was not uniform. Lots of fluorescent leakages and microglial cells were observed. Compared with the normal control group, there was no significant difference in the morphology and density of RGCs of sham operation group (P>0.05). In 1d, 3d, 7d and 14d after traction of the optic nerve groups, the number of RGCs were reduced progressively and the density of RGCs of the left eye was significantly lower than that in the normal control group (P<0.01). The survival rates of RGCs in the groups of 1d, 3d, 7d and 14d after optic nerve traction were (78.94±0.92)%, (60.07±0.90)%, (38.92±1.42)% and (17.31±0.97)% respectively.

?CONCLUSION:The transverse quantitative traction method can establish a model of easily quantifiable optic nerve injury, which can provide a powerful tool for further study on the treatment of optic nerve injury.

目的：采用橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，并利用熒光金逆行標記評價視神經(jīng)牽拉傷后視網(wǎng)膜節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的存活率。

方法：將25只雄性Wistar大鼠隨機均分為5組，即假手術(shù)組和視神經(jīng)牽拉傷后1、3、7、14d組。模型組用橫向張力計牽拉左眼視神經(jīng)，假手術(shù)組僅暴露左眼視神經(jīng)但不予牽拉，各組以右眼為正常對照。用熒光金逆行標記，并觀察假手術(shù)組及視神經(jīng)牽拉傷后1、3、7、14d組RGCs的密度。

結(jié)果：正常對照組RGCs形態(tài)多呈圓形或橢圓形，邊界清楚，細胞外無明顯熒光染料滲漏，部分可見明顯細胞突起；而視神經(jīng)牽拉傷后RGCs隨時間延長而不斷減少，細胞分布不均勻，并可見大量熒光滲漏及小膠質(zhì)細胞。與正常對照組相比，假手術(shù)組RGCs形態(tài)和密度無明顯差異(P>0.05)；視神經(jīng)牽拉傷后第1、3、7、14d的RGCs數(shù)量進行性減少，且其密度均明顯低于正常對照組(P<0.01)；視神經(jīng)牽拉傷后第1、3、7、14d的RGCs存活率分別為78.94%±0.92%、60.07%±0.90%、38.92%±1.42%和17.31%±0.97%。

結(jié)論：橫向定量牽拉法可以建立易于量化的視神經(jīng)損傷模型，為進一步研究視神經(jīng)損傷后的治療方法提供有力工具。

橫向定量牽拉法；視神經(jīng)損傷；熒光金；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

引用：谷新怡，周劍，趙朋波，等.橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)精確損傷模型.國際眼科雜志2016;16(9):1625-1628

0引言

外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy，TON)是一種嚴重的致盲眼病，目前無較好的治療方法，通過建立視神經(jīng)損傷動物模型對研究視神經(jīng)損傷機制及治療具有重要意義。國內(nèi)外學者通過大量的探索，研制出了各具特點的視神經(jīng)損傷動物模型，但由于它們自身的局限性，故不能完全成為滿意的視神經(jīng)損傷模型，本研究所采用的大鼠視神經(jīng)橫向定量牽拉傷模型，直接暴露視神經(jīng)進行定量損傷，具有可控性強、受力均勻、定量一致等特點，是較理想的視神經(jīng)損傷模型。

視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)數(shù)目進行性減少是導致視功能不可逆性損害的組織病理學基礎(chǔ)，RGCs的準確計數(shù)是目前國際上公認的評價視神經(jīng)損傷程度的重要形態(tài)學指標；同時，熒光金(fluoro-gold，F(xiàn)G)是Schmued等[1]在1986年發(fā)現(xiàn)的一種新型熒光物質(zhì)，也是目前較為穩(wěn)定的逆行熒光示蹤劑，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細胞的標記。本實驗首次采用橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，并利用熒光金立體定位注射法對RGCs逆行標記，檢測RGCs的存活率，評價橫向定量牽拉法對視神經(jīng)造成的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組選擇健康成年雄性Wistar大鼠(SPF級)25只，200～220g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。行外眼及眼底檢查，無眼疾者納入實驗，實驗期間于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室內(nèi)通風干燥。采用隨機數(shù)字表進行完全隨機化的分組，共分5組，即假手術(shù)組、視神經(jīng)牽拉傷后1、3、7、14d組，每組5只為一籠，共5籠。各組大鼠右眼均不處理，作為各組的正常對照眼。

1.1.2主要實驗試劑及儀器熒光金(美國Fluorochrome公司)，多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)，戊巴比妥鈉(AUKS公司)，水合氯醛(北京索萊寶科技有限公司)，腦立體定位儀(美國stoelting公司，51600型)，牙科鉆頭(瑞士Institut Straumann AG)，5μL微量注射器(上海安亭科學儀器廠)，橫向張力計(日本東京精機DTN-1)，直接檢眼鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)，體式解剖顯微鏡(日本Olympus公司，SZ61型)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司，IX81型)。

1.2方法

1.2.1 FG逆行標記RGCs各組大鼠分別于造模前7d采用雙上丘注射法逆行標記RGCs。常規(guī)20g/L戊巴比妥鈉(按100mg/kg大鼠體質(zhì)量)腹腔注射全身麻醉實驗大鼠。顱頂備皮，沿顱頂正中線向后垂直剪開皮膚約2cm，分離暴露前囟、冠狀縫、矢狀縫及人字縫；將大鼠固定于腦立體定位儀上，耳棒固定骨性耳道(兩邊刻度一致)，調(diào)節(jié)微量注射器針頭位于Bregma點，記錄讀數(shù)；調(diào)節(jié)針頭位于前囟后6.2mm，分別旁開1.4mm處，牙科鉆鉆孔，直徑約1mm；進針深5mm，退1mm，F(xiàn)G每孔注射2μL，1min內(nèi)勻速注射完畢，留針5min。另側(cè)上丘同樣操作。縫合皮膚，傷口涂抗生素眼膏，回籠飼養(yǎng)。

圖1正常大鼠視網(wǎng)膜RGCs分布及形態(tài)A：視網(wǎng)膜(×400)；B：距視盤1/6處的RGCs(×200)。

1.2.2橫向定量牽拉法制作視神經(jīng)損傷模型FG標記7d后進行視神經(jīng)牽拉傷模型制作。術(shù)前直接檢眼鏡查大鼠眼底視網(wǎng)膜及血管無異常。常規(guī)20g/L戊巴比妥鈉(按100mg/kg大鼠體質(zhì)量)腹腔注射全身麻醉實驗大鼠。在體式顯微鏡下進行造模操作，大鼠俯臥位，沿大鼠左眼顳側(cè)眶緣剪開皮膚，長約1cm，剪除上方部分眶脂肪，剪斷(亦可保留)外直肌，向眶尖部鈍性分離并剪開神經(jīng)鞘膜暴露視神經(jīng)，采用6-0類聚酯縫線在球后1～2mm處圈住視神經(jīng)并打結(jié)(圈長等于視神經(jīng)橫截面周長，注意不能拉緊)，縫線另一頭連接橫向張力計(最小刻度0.01N)，以 0.10N 拉力垂直于視神經(jīng)水平牽拉并持續(xù) 20s，另外整個操作過程均由同一個人完成以保證方向、力度的一致性。牽拉完成后立即觀察，如大鼠術(shù)眼瞳孔散大、直接對光反射消失、間接對光反射存在、眼底視網(wǎng)膜無血管出血或閉塞、視網(wǎng)膜蒼白缺血不超過5min，予以納入試驗，否則予以淘汰。術(shù)后縫合皮膚，常規(guī)抗炎，回籠飼養(yǎng)。

1.2.3視網(wǎng)膜鋪片和RGCs計數(shù)損傷組在視神經(jīng)牽拉傷后各時間點，假手術(shù)組在造模后1wk取視網(wǎng)膜。10%水合氯醛過量麻醉處死各組大鼠，于顳側(cè)做球結(jié)膜縫線標記，立即取出眼球并置于4%多聚甲醛-PBS溶液中固定2h。沿角鞏膜緣后0.5mm剪開眼球，去除角膜和晶狀體，分離視網(wǎng)膜，并在視網(wǎng)膜上、下、鼻、顳側(cè)各剪一小口，將視網(wǎng)膜置于載玻片上，滴防熒光淬滅劑后加蓋玻片，市售無色透明指甲油封片。將已鋪片的視網(wǎng)膜置于倒置熒光顯微鏡下觀察，紫外線激發(fā)熒光。在每張視網(wǎng)膜的鼻上、鼻下、顳上、顳下四個象限分別距視盤1/6、1/2和5/6視網(wǎng)膜半徑處共拍攝12張200×的熒光照片，對照片標記的RGCs直接進行人工計數(shù)，求平均值，其中圓形胞體、直徑超過8μm為RGCs，而形態(tài)不規(guī)則且直徑較小的為小膠質(zhì)細胞，不予計數(shù)[2-3]。最終計算出每平方毫米視野范圍內(nèi)的RGCs數(shù)，以及RGCs的標識率和喪失率(標識率=每只大鼠損傷眼RGCs/正常對照眼RGCs×100%，RGCs喪失率=1-RGCs標識率)。

圖2距視盤1/6處的RGCs(×200)A：假手術(shù)組；B：視神經(jīng)牽拉傷后1d，F(xiàn)G標記RGCs與假手術(shù)組比較略減少;C：視神經(jīng)牽拉傷后3d的RGCs；D：視神經(jīng)牽拉傷后7d的RGCs；E：視神經(jīng)牽拉傷后14d的RGCs(箭頭所指為吞噬了死亡RGCs及熒光金的小膠質(zhì)細胞)。

表1各組大鼠RGCs密度

，細胞數(shù)/mm2)

注：bP<0.01vs右眼(對照眼)；dP<0.01vs左眼(損傷眼)。

2結(jié)果

2.1熒光金標記的正常大鼠視網(wǎng)膜RGCs分布及形態(tài)熒光金標記的RGCs在倒置熒光顯微鏡下觀察，在視網(wǎng)膜各象限分布均勻，視盤周圍的中心區(qū)域RGCs分布較周邊部密集，視網(wǎng)膜血管自視盤呈放射狀向外分布，且血管走行區(qū)未見RGCs。標記的細胞形態(tài)多呈圓形或橢圓形，胞漿呈強熒光，邊界清楚，胞體直徑大于8μm，細胞外無明顯熒光染料滲漏(圖1)。

2.2熒光金標記的視神經(jīng)損傷后大鼠視網(wǎng)膜RGCs形態(tài)及分布視神經(jīng)牽拉傷后1d，視網(wǎng)膜中熒光金標記的RGCs數(shù)量與假手術(shù)組比較略減少，但細胞形態(tài)未見明顯變化，且細胞外未見明顯FG滲漏(圖2)。損傷后3d，視網(wǎng)膜中FG標記的RGCs數(shù)量進一步減少，胞漿中熒光分布不均勻，部分FG滲漏到細胞外，并可見少量小膠質(zhì)細胞(圖2C，如箭頭所示)。損傷后7d，視網(wǎng)膜中FG標記的RGCs明顯減少，可見大量吞噬了死亡RGCs及熒光金的小膠質(zhì)細胞，形態(tài)多為雙極形，直徑小(圖2D，箭頭所示)。損傷后14d，視網(wǎng)膜中FG標記的RGCs數(shù)量更少，分布不規(guī)律，F(xiàn)G滲漏增多，可見大量小膠質(zhì)細胞，其胞體呈不規(guī)則形狀(圖2E)。

2.3各組大鼠RGCs存活情況

2.3.1各組大鼠RGCs密度假手術(shù)組左眼與右眼兩個樣本比較，服從正態(tài)分布，采用配對樣本t檢驗，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明僅暴露視神經(jīng)未對視神經(jīng)造成損傷；1d組、3d組、7d組及14d組的視神經(jīng)損傷眼(左眼)與自身正常對照眼(右眼)比較，各組樣本均服從正態(tài)分布，經(jīng)過配對樣本t檢驗分析，結(jié)果顯示差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。假手術(shù)組、1d組、3d組、7d組及14d組五組間左眼(即視神經(jīng)損傷眼)RGCs密度比較，采用one-way ANOVA分析，分析結(jié)果顯示，各組間總體差異具有統(tǒng)計學意義(F=897.669,P<0.01)。將五組變量進行兩兩比較，經(jīng)one-way ANOVA分析顯示，并經(jīng)Bonferroni法將檢驗水準進行校正，結(jié)果顯示五組間左眼RGCs密度的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1，圖3)。

圖3各組大鼠RGCs密度bP<0.01vs右眼(對照眼)；dP<0.01vs損傷眼的假手術(shù)組。

圖4各組大鼠RGCs標識率bP<0.01vs假手術(shù)組。

2.3.2各組大鼠RGCs標識率經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗分析，各組RGCs標識率比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，經(jīng)ANOVA-Games-Howell分析，各組間均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表2，圖4)。

3討論

外傷性視神經(jīng)損傷是眼科常見致盲眼病，其組織病理學基礎(chǔ)為RGCs的進行性死亡，目前多采用視神經(jīng)管減壓術(shù)或大劑量激素沖擊進行治療，但臨床效果不理想，為了研究視神經(jīng)損傷的機制及有效治療方法，首先需要研制出穩(wěn)定的、操作簡便的、可重復性強的、易于標化且類似于人類視神經(jīng)損傷狀態(tài)的視神經(jīng)損傷動物模型。國內(nèi)外學者通過大量探索，研究出各具特點的外傷性視神經(jīng)損傷模型，目前研究最為廣泛的主要包括視神經(jīng)橫斷傷、視神經(jīng)夾持傷、視神經(jīng)撞擊傷及視神經(jīng)牽拉傷動物模型，各有利弊。

組別眼數(shù)RGCs的標識率(%)假手術(shù)組596.71±5.871d組578.94±0.92b3d組560.07±0.90b7d組538.32±1.63b14d組517.31±0.97bχ223.077P<0.01

注：bP<0.01vs假手術(shù)組。

視神經(jīng)橫斷傷動物模型是各種視神經(jīng)損傷模型中最容易統(tǒng)一致傷量，且操作簡便的模型[4-6]，但是該模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突完全離斷，使其在隨后的視神經(jīng)保護治療研究等方面存在著很大的局限性，限制了其在視神經(jīng)損傷研究中的應(yīng)用。視神經(jīng)夾持傷是目前實驗研究中應(yīng)用最廣泛的方法[7]，具有設(shè)計簡單、易于操作、創(chuàng)傷性小、成模率高，且能夠保證視神經(jīng)髓鞘的完整性等特點，然而根據(jù)文獻報道[8-11]，對于該模型所使用的夾持器械(包括血管鉗、動脈瘤夾、視神經(jīng)鉗夾等)以及夾持的力度和時間等方面難以保持統(tǒng)一的規(guī)范，受多種因素影響，且損傷量過大，因此缺乏統(tǒng)一的、可控制的致傷標準。視神經(jīng)撞擊傷是一種十分接近臨床的間接性損傷模型，利用間接撞擊力通過顱骨傳導至視神經(jīng)，主要包括閉合性和開放性撞擊法[12]，雖然該模型與臨床外傷性視神經(jīng)損傷特點比較吻合，但是人與實驗動物在解剖結(jié)構(gòu)上存在很大差異，且其存在造模操作復雜、設(shè)備要求高、動物致死率高等不足，因此并不是理想的模型。視神經(jīng)牽拉傷動物模型類似于部分外傷性損傷及手術(shù)牽拉損傷，其方向可以分為與視神經(jīng)管平行或與視神經(jīng)管垂直，前者模擬了視神經(jīng)的彌漫性軸索損傷，后者類似視神經(jīng)管骨折所致的切割傷；該模型進行實驗研究可以獲得較好的臨床意義，但該模型手術(shù)步驟復雜、操作難度大，不利于開展大量研究工作[13-16]。本研究采用橫向定量牽拉法制作大鼠外傷性視神經(jīng)損傷模型，直接暴露視神經(jīng)，用聚酯縫合線圈住視神經(jīng)，可控性較強，且視神經(jīng)受力均勻、定量一致，對視網(wǎng)膜各個部位的損傷基本相同，是較理想的視神經(jīng)損傷模型。

視神經(jīng)損傷后直接受累的是RGCs，對其標記的方法主要有辣根過氧化物酶及各種熒光染料等，但是前者參與細胞代謝，易從標記的細胞內(nèi)擴散到周圍組織，且照射后褪色較快，無法在細胞中長期儲存。而熒光金[1]在細胞內(nèi)分解緩慢，不易擴散，與周圍組織分界清楚，且靈敏度高，不易淬滅，不僅能清楚顯示RGCs的形態(tài)學特征，還能對RGCs進行計數(shù)。本研究采用橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，以FG為標記物，通過軸漿運輸逆行標記RGCs，觀察RGCs的形態(tài)及數(shù)量，從而評價大鼠視神經(jīng)牽拉傷后RGCs的存活率。結(jié)果顯示，F(xiàn)G能夠較好地標記RGCs，并在正常視網(wǎng)膜中顯示標記的RGCs呈金黃色，形態(tài)多為圓形或橢圓形，邊界清楚，易于計數(shù)。正常對照組(右眼)與假手術(shù)組(僅暴露視神經(jīng)的左眼)的RGCs密度相比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.283>0.05)，說明僅暴露視神經(jīng)而不予牽拉不會造成視神經(jīng)損傷；而視神經(jīng)牽拉傷后第1、3、7、14d的RGCs存活率進行性下降(78.94%、60.07%、38.32%、17.31%，P<0.01)，明確展示了RGCs在視神經(jīng)損傷后的消亡過程，表明橫向定量牽拉法可以建立易于量化的視神經(jīng)損傷模型，為進一步研究視神經(jīng)損傷后的治療方法提供有力工具。

1 Schmued LC, Fallon JH. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.BrainRes1986；377(1):147-154

2 Cheng L, Sapieha P, Kittlerova P,etal. TrkB gene transfer protects retinal ganglion cells from axotomy-induced deathinvivo.JNeurosci2002;22(10):3977-3986

3 Germain F, Calvo M, Villa P. Rabbit retinal ganglion cell survival after optic nerve section and its effect on the inner plexiform layer.ExpEyeRes2004;78:95-102

4 Koeberle PD, Wang Y, Schlichter LC. Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transectioninvivo.CellDeathDiffer2010;17(1):134-144

5 Stowell C, Arbogast B, Cioffi G,etal. Retinal proteomic changes following unilateral optic nerve transection and early experimental glaucoma in non-human primate eyes.ExpEyeRes2011；93(1):13-28

6 Wong WK, Cheung AW, Yu SW,etal. Hepatocyte growth factor promotes long-term survival and axonal regeneration of retinal ganglion cells after optic nerve injury: comparison with CNTF and BDNF.CNSNeurosciTher2014；20(10):916-929

7 Templeton JP, Geisert EE. A practical approach to optic nerve crush in the mouse.MolVis2012；18:2147-2152

8 Zhang ZZ, Gong YY, Shi YH,etal. Valproate promotes survival of retinal ganglion cells in a rat model of optic nerve crush.Neuroscience2012；224(8):282-293

9 Zaverucha-do-Valle C, Mesentier-Louro L, Gubert F,etal. Sustained effect of bone marrow mononuclear cell therapy in axonal regeneration in a model of optic nerve crush.BrainRes2014；1587(31):54-68

10廖良,徐銘謙,韋企平,等.鉗夾法造成大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞過量丟失.眼科新進展 2011;31(2):101-104

11曹霞,姜曉璇,馬林昆,等.大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型的建立及磁共振成像運用初探. 眼科新進展 2014;4(3):205-208

12王一,周繼紅,許立軍,等.間接視神經(jīng)損傷動物模型的研制.中華創(chuàng)傷雜志 1999;15(4):287-289

13 Gennarelli TA, Maxwell WL, Thibault LE,etal. Axonal injury in the optic nerve: a model simulating diffuse axonal injury in the brain.JNeurosurg1989;71(2):244-253

14秦波，成洪波，黃麗娜，等. 牽拉性視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)中MDA、SOD水平的改變.眼科新進展 2007;27(4):283-284

15王開仕,王正敏.視神經(jīng)牽拉傷的實驗研究.上海醫(yī)學 2002;25(8):479-483

16 Maxwell WL, Bartlett E, Morgan H. Wallerian degeneration in the optic nerve stretch-injury model of traumatic brain injury: a stereological analysis.JNeurotrauma2015;32(11):780-790

Transverse quantitative traction method making optic nerve precise injury model in rats

Xin-Yi Gu1, Jian Zhou1, Peng-Bo Zhao1, Ai-Wei Liu1, Shan-Shan Shang2, Xiao-Ling Yan1, Lu-Hua Wu2, Yan-Ting Xia1

2016-04-20Accepted：2016-08-08

?transverse quantitative traction method; optic nerve injury; fluorogold; retinal ganglion cells

國家自然科學基金面上項目(No.81173307)；北京市自然科學基金面上項目(No. 16G40086)

1(100078)中國北京市，北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院眼科；2(100029)中國北京市，北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院眼科

谷新怡，在讀博士研究生，研究方向：視神經(jīng)疾病。

周劍，碩士，主任醫(yī)師，博士研究生導師，主任，研究方向：視神經(jīng)疾病.zhj9667@126.com

2016-04-20

2016-08-08

Gu XY, Zhou J, Zhao PB,etal. Transverse quantitative traction method making optic nerve precise injury model in rats.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(9):1625-1628

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.9.06