高志奎，劉　冉，尹立紅，浦躍樸

miR-338基因簇與食管癌發(fā)病風險的病例對照研究

高志奎，劉冉*，尹立紅，浦躍樸

（東南大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇南京210009）

目的： 探討miR-338基因簇在食管癌組織中的表達模式及其與食管癌發(fā)病風險的關系。方法：選取86例經(jīng)病理確診的食管癌患者，分別提取食管癌和癌旁組織總RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p與hsa-miR-657的表達，應用配對樣本t檢驗分析癌和癌旁組織中miRNA表達差異，Pearson相關分析檢驗基因簇各miRNA表達的相關性，logistic回歸分析miRNA異常表達對食管癌發(fā)病風險的影響。結果：hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p在食管癌組織中的表達均較癌旁組織降低(P均＜0.05)，hsa-miR-657在食管癌和癌旁組織中表達的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p表達顯著相關(r=0.754，P＜0.05)，hsa-miR-338-5p的低表達增加了食管癌的發(fā)病風險(OR=1.264，P＜0.05)，可能是食管癌的危險因素。結論：miR-338 基因簇可能抑制了食管癌的發(fā)生，hsa-miR-338-5p可能成為食管癌診斷的潛在標志物。

miR-338；基因簇；食管癌；生物標志物

【ABSTRACT】OBJECTIVE: T o i nvestigate t he e xpression l evel o f m iR-338 c luster i n e sophageal c arcinoma a nd i dentifythe relationship between miR-338 cluster and esophageal carcinoma. METHODS：A total of 86 cases of patients withconfirmed esophageal carcinoma were selected，real time RT-PCR were performed to detect the expression of hsa-miR-338-3p，hsa-miR-338-5p and hsa-miR-657. We used paired t-test to analyze the expression of miRNA in tumor and adjacentnon-tumor tissues，Pearson correlation analysis to examine the correlation of the expression of each miRNA and logisticregression a nalysis t o a nalyze t he e ffect o f a bnormal e xpression o f m iRNAs o n t he r isk o f e sophageal c ancer. R ESULTS：hsamiR-338-3p and hsa-miR-338-5p were downregulated in tumor tissues compared with adjacent non-tumor tissues(P＜0.05)，and no statical difference was found of the expression of hsa-miR-657 between the two tissues (P＞0.05). Theexpression of hsa-miR-338-3p and hsa-miR-338-5p were significantly correlated (r=0.754，P＜0.05)，and low expressionof hsa-miR-338-5p was the risk factor for esophageal carcinoma (OR=1.264，P＜0.05). CONCLUSION：miR-338 clustermay play an important role in the formation process of esophageal carcinoma. In addition hsa-miR-338-5p may represent themiR-338 c luster t o b e a u seful b iomarker f or d iagnosis.

【KEY WORDS】miR-338；cluster；esophageal carcinoma；biomarker

microRNA(miRNA)是一類可參與內(nèi)源性靶基因調(diào)節(jié)的非編碼RNA，長度約為22～28個核苷酸[1]，已有大量研究證實其異常表達可能導致腫瘤的發(fā)生，影響其發(fā)展和預后[2-3]。miRNA在其啟動子和操縱子的作用下進行表達，通常多個miRNA基因在染色體上聚集排列形成基因簇[4]。

由于位置的特殊性，一些成簇分布的miRNA受到共同的調(diào)控并以多順反子的形式轉(zhuǎn)錄[5]。其編碼產(chǎn)物在功能上可能會存在某種協(xié)同或者拮抗作用。有研究證實，一些miRNA基因簇在功能上比單個miRNA具有更高效的作用[6]。目前研究較多的miR-17-92、miR-143-145基因簇在多種動物、組織中影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，基因簇編碼的各成熟miRNA發(fā)揮了一種協(xié)同作用[7-10]。

我們前期的食管癌miRNA芯片結果顯示miR-338-3p在癌組織中表達下調(diào)[11]，miRbase數(shù)據(jù)庫(http：//www.mirbase.org/)資料顯示miR-338基因簇是一個在動物中高度保守的基因簇，hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-657編碼基因共同參與組成miR-338基因簇。上述3個miRNA的編碼基因均位于AATK基因內(nèi)含子區(qū)，基因簇長度為673 bp，miR-338 基因簇可能在相同的啟動子和調(diào)控子的作用下表達，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中共同發(fā)揮重要作用。

有關miR-338基因簇的研究多局限于組成基因簇的單一成熟miRNA，本研究旨在通過檢測miR-338基因簇編碼的各miRNA在食管癌和癌旁組織中的表達，進而分析該基因簇的表達與食管癌發(fā)病的關系并初步探討miR-338基因簇的表達模式。

1　材料與方法

1.1人體組織樣本及一般資料

選取淮安市第一人民醫(yī)院2009—2011年86例術后病理診斷食管癌患者。其中男性54例(62.8%)，女性32例(37.2%)，患者平均年齡(61.13±7.56)歲。收集外科手術切除的食管癌組織及對應癌旁組織標本，將組織剪至0.5 cm3大小，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑和設備

Trizol試劑購自Invitrogen公司，SYBR Green Mix 購自Toyobo公司；MMLV購自Promega公司；dNTP 購自天根公司；核糖核酸酶抑制劑購自Thermo公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物購自銳博公司。

梯度基因擴增儀、低溫高速離心機購自Eppendorf公司；Step one-Plus熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3實驗方法

使用Trizol提取組織總RNA，real time PCR測定成熟miRNA的表達，RiboBio Bulge-LoopTM引物進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR。

呼倫忙給他賠不是，說老人不懂規(guī)矩，還望多多擔當包涵，并保證這樣的事情不會再一次發(fā)生。對方倒是客氣，說沒事沒事，只需補栽幾棵草也不麻煩。如果這草坪他自己說了能算，就讓老人種上幾棵豆角。誰家沒有老人呢？只要能哄老人開心，草坪全部鏟光了都沒有關系。只是草坪是大家的，如果鄰居們紛紛效仿，這草坪豈不成了菜園子？呼倫說那是那是。點頭哈腰地將物業(yè)管理人員送走，轉(zhuǎn)身剛想發(fā)作，見丈母娘正可憐巴巴地盯著自己，一副低頭認罪聽候處理的樣子，也就不忍心再動干戈，忙擺擺手說沒事沒事，一頭扎進書房，把自己包得像一只過冬的狗熊。

1.3.1逆轉(zhuǎn)錄取RNA模版0.5 μg，RT引物工作液1 μL，加無核酸酶水5.5 μ L，70 ? C 加 熱10 m in，立即置于冰上2 min；隨后加入5×RT Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，200 U/μL MMLV 0.25 μL，40 U/μL 核糖核酸酶抑制劑0.25 μL，無酶水3 μL，置于PCR儀，42℃、1 h ，70 ℃ 、10 m in，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于定量PCR。

1.3.2實時熒光定量PCR反應體系：SYBR?Green PCR Master mix 4.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL，無酶水3.7 μL。反應程序：95 ℃預熱5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s；40個循環(huán)，每個循環(huán)72 ℃收集熒光。熔解曲線：60～95 ℃每升溫0.3 ℃ 收集熒光。

PCR產(chǎn)物的定量校正：選取U6為內(nèi)參，同一樣本miRNA與U6的CT值 相減，得到該樣本miRNA的相對表達量?CT值 。?CT值 越大，表明實際表達量越低。

1.4統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.2完成，癌組織和癌旁組織中miRNA表達水平差異的分析采用配對樣本t檢驗方法，各miRNA表達水平的相關性分析采用Pearson相關分析方法，miRNA異常表達與食管癌患病關系的分析采用logistic回歸分析方法，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1miR-338基因簇成熟miRNA的表達

對癌組織和癌旁組織中成熟miRNA的相對表達量進行配對樣本t檢驗(見表1)，與癌旁組織相比，食管癌組織中hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p顯著低表達，其表達量(2-??CT)分別是癌旁組織的0.621和0.506，hsa-miR-657在兩種組織中的表達差異則無統(tǒng)計學意義。

表1　食管癌中miR-338基因簇的相對表達

對hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p和hsa-miR-657的相對表達量?CT進 行Pearson相關分析(見圖1)，結果顯示3組miRNA相互之間表達的相關性均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p表達高度相關 (r=0.754，P＜0.05)；hsa-miR-657與hsamiR-338-3p的相關系數(shù)為0.653，與hsa-mi-338-5p的相關系數(shù)為0.500。

圖1　miRNA表達的相關性分析

2.3miRNA表達與食管癌患病風險

為了評估m(xù)iRNA異常表達與食管癌患病之間的關系，對數(shù)據(jù)進行1∶1配對條件logistic回歸分析(見表2)。結果顯示hsa-miR-657的表達未引起食管癌發(fā)病風險的改變，hsa-miR-338-5p、hsa-miR-338-3p表達的降低會增加食管癌的發(fā)病風險。

表2　miRNA異常表達與食管癌患病風險的條件logistic回歸分析

對hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p進行多因素logistic回歸分析(見表3)，最終hsa-miR-338-5p進入方程，hsa-miR-338-5p低表達會引起食管癌發(fā)病風險升高(OR=1.264，P＜0.05)。

表3　miR-338基因簇與食管癌發(fā)病風險的條件logistic回歸分析

3　討論

有研究表明miR-338-3p在多種癌組織和細胞中下調(diào)表達并發(fā)揮重要作用。在結直腸癌細胞中，miR-338-3p可以抑制Smoothened蛋白表達，進而抑制細胞的侵襲和遷移能力[12]。在胃癌細胞中，miR-338-3p可直接作用于ZEB2和MACC1，抑制上皮間質(zhì)化過程[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-338-3p可以抑制食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成，在裸鼠中過表達miR-338-3p，種植腫瘤的生長受到抑制，本研究顯示miR-338-3p在人食管癌中顯著低表達(t=2.983，P＜0.05)，miR-338-3p可能在人食管癌的形成中發(fā)揮了抑制作用。

有研究發(fā)現(xiàn)miR-338-5p在結直腸癌組織和血漿中異常表達，肝癌患者血漿中miR-338-5p與AFP表達負相關，miR-338-5p可能成為結直腸癌和肝癌的早期診斷標志物[15-16]。對移植腎臟組織研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-5p表達與移植患者的生存顯著相關，miR-338-5p可以作用于TRAF3，引起B(yǎng)AFF信號的改變，從而引起移植腎臟后免疫反應的改變[17]。與多種癌組織中低表達趨勢相一致，本研究發(fā)現(xiàn)miR-338-5p在人食管癌中顯著低表達(t=4.309，P＜0.05)，其可能成為食管癌的診斷標志物。

Yan等[18]研究發(fā)現(xiàn)早期喉癌中miR-657異常表達，統(tǒng)計分析表明miR-657可以較好的區(qū)分早期喉癌和正常黏膜組織，其可能成為早期喉癌的診斷標志物。miR-657可以結合IGF2R的3'UTR區(qū)并參與調(diào)節(jié)Hep-G2細胞中IGF2R的表達，Lv等[19]分析認為其與2型糖尿病AACA序列的插入和缺失相關。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-657高表達，在免疫缺陷小鼠中過表達miR-657可見肝癌細胞的增殖以及克隆形成能力增強，實驗證實miR-657可以作用于TLE1，通過NF-kappa B信號通路促進肝癌的形成。本研究并未發(fā)現(xiàn)食管癌和癌旁組織中miR-657的表達存在顯著差異，推測可能是miR-657的組織、時間特異性表達所致。

我們應用Pearson相關對miR-338基因簇各miRNA的表達進行分析，結果顯示，hsa-miR-338-3p、hsamiR-338-5p、hsa-miR-657在表達上高度相關(P＜0.05)，來自于同一前體的hsa-miR-338-3p與hsa-miR-338-5p相關系數(shù)高達0.754，位置上緊密排列的miR-338基因簇表達miRNA的過程可能受到某些共同的調(diào)控。多因素logistic分析顯示hsa-miR-338-5p的低表達是食管癌的危險因素(OR=1.264，P＜0.05)，hsa-miR-338-3p并未進入最終方程，考慮是由于兩者之間表達高度相關所致。

綜上，miR-338基因簇可能作為一個整體，參與了復雜的分子信號調(diào)控網(wǎng)絡，共同影響了食管癌的發(fā)生發(fā)展，hsa-miR-338-5p可能在該通路的調(diào)控中發(fā)揮了主要作用，其可能代表miR-338基因簇成為食管癌診斷的標志物。miR-338基因簇調(diào)控食管癌的分子機制有待于進一步實驗的研究。

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A case-control study on the risk of esophageal carcinoma and miR-338 cluster

GAO Zhikui，LIU Ran*，YIN Lihong，PU Yuepu
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

R730.2

A

1004-616X(2016)02-0107-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.005

2015-11-17；

2016-01-04

國家自然科學基金(81172747，81573108，81573191)

作者信息： 高志奎，E-mail：gaozhikuijy@163.com。*

，劉冉，E-mail：ranliu@seu.edu.cn