CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡和中齡果蠅心臟功能、攀爬能力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性的影響

文登臺(tái),　鄭　瀾,　奉　悅,　倪　柳,　王　卉,　張　民

(湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院，湖南 長沙 410012)

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?運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)?

CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡和中齡果蠅心臟功能、攀爬能力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性的影響

文登臺(tái),鄭瀾,奉悅,倪柳,王卉,張民

(湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院，湖南 長沙 410012)

目的:構(gòu)建NAD合成酶基因CG9940全身過表達(dá)并進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù),研究NAD合成酶基因CG9940過表達(dá)對(duì)幼齡和中齡果蠅心臟功能、攀爬能力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性的影響。方法:y[1]w[67c23]P{y[+m8]=Mae-UAS.6.11}CG9940[GG01267]雌性果蠅分別與W1118雄性果蠅、arm-Gal4雄性果蠅雜交取F1代,分7d齡幼齡組和21 d齡中齡組,各年齡組分為對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組、過表達(dá)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組,每組400只處女蠅。幼齡組飼養(yǎng)至第2 d齡開始訓(xùn)練,中齡組飼養(yǎng)至第16 d齡開始訓(xùn)練,連續(xù)訓(xùn)練5 d,分別于第7 d齡和21 d齡取材。qRT-PCR測定幼齡組CG9940基因mRNA表達(dá)量,M-mode心動(dòng)圖檢測果蠅心臟心率和射血分?jǐn)?shù),測量攀爬指數(shù)。結(jié)果:析因結(jié)果表明CG9940基因過表達(dá)的構(gòu)建對(duì)基因表達(dá)水平有影響(P<0.01),運(yùn)動(dòng)對(duì)CG9940基因表達(dá)水平無影響(P>0.05),過表達(dá)對(duì)照組CG9940 mRNA 過表達(dá)率為155.2%,運(yùn)動(dòng)組為152.0%。在幼齡組中,與對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng)組、過表達(dá)對(duì)照組縮短分?jǐn)?shù)增大(P<0.05),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組攀爬指數(shù)增大(P<0.05)、心率降低(P<0.05)、縮短分?jǐn)?shù)升高(P<0.01),其余各組比較無顯著性差異。中齡組中,與對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng)組心率降低(P<0.05)、縮短分?jǐn)?shù)增大(P<0.05),過表達(dá)對(duì)照組心率降低(P<0.05)、縮短分?jǐn)?shù)增大(P<0.05),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組攀爬指數(shù)增大(P<0.01)、心率降低(P<0.01)、縮短分?jǐn)?shù)升高(P<0.01),其余各組比較無顯著差異。結(jié)論:果蠅NAD合成酶基因過表達(dá)產(chǎn)生的NAD適應(yīng),能增強(qiáng)幼齡和中齡果蠅心臟泵血功能、心臟自律性、攀爬能力對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的敏感性,產(chǎn)生明顯運(yùn)動(dòng)效益,提示NAD合成酶基因表達(dá)改變可能會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)敏感性產(chǎn)生影響;對(duì)于NAD合成酶基因表達(dá)上調(diào)個(gè)體,早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)能更有效降低心臟疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),增強(qiáng)心臟功能,提高運(yùn)動(dòng)能力。

CG9940基因;果蠅；運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性;心臟功能;攀爬能力

Author’s addressSchool of Physical Education,Hu’nan Normal University,Changsha 410012,Hu’nan,China

心臟作為人體最重要的器官之一,其疾病的發(fā)生呈現(xiàn)早發(fā)趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國1～17 歲死亡的未成年人中死于冠心病的人數(shù)占死亡總?cè)藬?shù)的12.4%,居死亡原因第1位[1]。值得注意的是，在年齡低于12歲且嚴(yán)重肥胖的青少年中,有62%的人已經(jīng)存有一種或多種心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因子[2-3];因此，早期采取有效的干預(yù)措施可降低心臟疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。越來越多的研究表明，運(yùn)動(dòng)能對(duì)青少年機(jī)體產(chǎn)生多方面效益,包括預(yù)防肥胖、增強(qiáng)心肺功能以及降低心臟疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]等。然而,運(yùn)動(dòng)也會(huì)對(duì)少數(shù)個(gè)體產(chǎn)生不良效應(yīng),有研究表明高水平運(yùn)動(dòng)員患?xì)獯瓦^敏性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高,這可能與遺傳感受性、神經(jīng)介導(dǎo)炎癥和上皮敏感性等有關(guān)[5]?；虮磉_(dá)水平不同是導(dǎo)致遺傳感受性不同的主要原因之一,表達(dá)水平不同導(dǎo)致個(gè)體對(duì)應(yīng)激的敏感性不同[6],進(jìn)而產(chǎn)生不同程度或方向的應(yīng)激適應(yīng)。故在不同的遺傳背景下,研究個(gè)體對(duì)早期運(yùn)動(dòng)應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生怎樣的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)也變得十分有意義。

過表達(dá)是基因表達(dá)改變的表現(xiàn)形式之一,通過過表達(dá)研究基因功能是反向遺傳學(xué)基因功能研究的重要方法[7]。果蠅CG9940基因編碼NAD合成酶,它與人類的NADsyn1和NADsyn2,以及酵母的谷氨酰胺依賴的NAD合成酶(Glutamine-dependent NAD synthetase,Qns1)基因?qū)偻椿?細(xì)胞中NAD合成酶是參與由NAAD合成NAD的關(guān)鍵酶,NAD參與能量代謝、氧化應(yīng)激及鈣離子動(dòng)員等許多生化過程[8-12]。前期研究結(jié)果顯示,過表達(dá)NAD合成酶基因CG9940有益于幼齡和中齡果蠅的心臟功能和運(yùn)動(dòng)能力[13],但在此遺傳背景下幼齡和中齡果蠅心臟功能以及運(yùn)動(dòng)能力對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的敏感性仍未知。為確定CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡和中齡果蠅心臟功能及運(yùn)動(dòng)能力的運(yùn)動(dòng)敏感性是否有影響,筆者構(gòu)建果蠅基因CG9940正常表達(dá)和過表達(dá)品系,并在果蠅生命早期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù),對(duì)干預(yù)后的心臟功能和運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行檢測分析,旨在為運(yùn)動(dòng)預(yù)防生命早期心臟疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1果蠅品系、雜交及分組CG9940過表達(dá)品系y[1]w[67c23]P{y[+m8]=Mae-UAS.6.11}CG9940[GG01267](購于美國Bloomington Drosophila Stock Center,品系號(hào):14158),野生型W1118和arm-Gal4品系由湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育中心饋贈(zèng)。通過arm-Gal4品系與y[1]w[67c23]P{y[+m8]=Mae-UAS.6.11}CG9940[GG01267]品系雜交,后代可獲得全身CG9940基因過表達(dá)[14-15]。

雜交方案為:y[1]w[67c23]P{y[+m8]=Mae-UAS.6.11}CG9940[GG01267]品系雌性果蠅分別與W1118或arm-Gal4品系雄性果蠅雜交,收集F1代8～12 h內(nèi)羽化的處女蠅,依據(jù)遺傳背景不同,前者分為對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組,后者分為過表達(dá)對(duì)照組、過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組;按年齡又分為幼齡(7 d齡)組和中齡(21 d齡)組,共8組,每組400只,20只/管,于HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠制造)中,保持25 ℃溫度、50%濕度,12 h晝∕夜循環(huán)飼養(yǎng)。

1.2運(yùn)動(dòng)方案 采用自主研制的果蠅平臺(tái)運(yùn)動(dòng)裝置對(duì)果蠅進(jìn)行中等強(qiáng)度耐力訓(xùn)練[16],運(yùn)動(dòng)組和過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組培養(yǎng)管底部的海綿距頂部綿塞8 cm作為果蠅逆重力攀爬運(yùn)動(dòng)區(qū)域。為排除平臺(tái)震動(dòng)的干擾,訓(xùn)練期間對(duì)照組和過表達(dá)對(duì)照組試管底部海綿與綿塞間留出1.5～2.5 mm距離,使果蠅隨平臺(tái)上下震動(dòng)而不做攀爬運(yùn)動(dòng)。幼齡組第2 d齡開始訓(xùn)練,中齡組第16 d齡開始訓(xùn)練,訓(xùn)練時(shí),對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組、過表達(dá)對(duì)照組和過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組均置于運(yùn)動(dòng)平臺(tái)上,運(yùn)動(dòng)頻率由電機(jī)裝置控制為24 s/轉(zhuǎn),每天運(yùn)動(dòng)2.5 h,連續(xù)5 d[17]。幼齡組第7 d齡取材,中齡組第21 d齡取材。

1.3果蠅培養(yǎng)基以配制2 L水的培養(yǎng)基為例(可按比例增減量),加熱前先加入黃豆粉40.20 g,酵母粉49.60 g和玉米粉168.00 g攪勻,加熱過程中再加入瓊脂17.10 g直至沸騰。沸騰后停火,冷卻過程中加入蔗糖和麥芽糖各123.20 g,麥芽糖要慢慢加入,防止成團(tuán),待蔗糖和麥芽糖溶解后,加入丙酸6.67 mL、對(duì)羥基苯6.67 g溶于66.67 mL無水乙醇,充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶盅b于潔凈的培養(yǎng)試管中,每管培養(yǎng)基厚度為0.5～1.0 cm。

1.4指標(biāo)檢測

1.4.1qRT-PCR檢測取安靜組、運(yùn)動(dòng)組、過表達(dá)組和過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組第7 d幼齡果蠅作qRT-PCR檢測,每組取100 mg(10只果蠅)組織樣品研為勻漿,用Tripure試劑(Roche公司產(chǎn))提取RNA。然后用RNeasey mini spin cloumn試劑盒(Qiagen公司產(chǎn))對(duì)RNA進(jìn)行純化,用紫外分光光度計(jì)(美國 Amersham Biosciences公司產(chǎn))定量,引物使用Premiers5.0軟件設(shè)計(jì),并經(jīng)NCBI BLAST基因庫檢索驗(yàn)證,與其他基因無高度同源性,以rp49 基因?yàn)閮?nèi)參。引物由上海生物工程生物制品有限公司合成、純化。其序列如表1所示,取2 μL RNA,逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,PCR 擴(kuò)增后用2%的瓊脂糖電泳鑒定。

表1　引物及內(nèi)參設(shè)計(jì)

取稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL,加入SYBR?Premix Ex Taq(2×)15 μL(Takara)、PCR Forward Primer(10 μmol/L) 1 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL、ROX 0.6 μL、ddH2O 7.4 μL,總體系 30 μL,分3個(gè)重復(fù)孔,每孔10 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 變性 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束,由熔點(diǎn)曲線判定 PCR 反應(yīng)的特異性。根據(jù)熒光曲線的 Ct 值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算定量結(jié)果,檢測在ABI 7900HT(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn))中進(jìn)行。計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)值以及根據(jù)相對(duì)表達(dá)值計(jì)算平均過表達(dá)量,過表達(dá)率=(過表達(dá)組-對(duì)照組)/對(duì)照組(均為平均過表達(dá)量)。

1.4.2M-mode心動(dòng)圖檢測心臟功能的變化將果蠅置于麻醉瓶(內(nèi)含三酰胺麻醉劑,FlyNapTM)麻醉5 min,在一個(gè)直徑為2 cm透明培養(yǎng)皿底部均勻涂上薄層凡士林,用鑷子將麻醉果蠅腹部朝上,使其背部和翅膀粘于凡士林上,倒入氧化的果蠅人工血淋巴(人工血淋巴:果蠅血淋巴配劑、蔗糖、海藻糖按照8∶1∶1的比例制成,4 ℃保存),在體視-冷光源顯微鏡下,去除果蠅頭部、腹側(cè)胸腔和腹部表皮,用微細(xì)玻璃管吸去內(nèi)臟及脂肪組織,暴露心管,采用EM-CCD高速攝像機(jī)(日本HAMAMATS公司產(chǎn))鏡下拍攝果蠅心臟跳動(dòng)顯微影像,拍攝時(shí)長為20 s,頻率為130幀/s,利用HC-Image 軟件記錄并處理視頻數(shù)據(jù),采用半自動(dòng)光學(xué)心動(dòng)分析軟件(Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis software,SOHA,由美國伯納姆醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)學(xué)和衰老中心Karen Ocorr和Rolf Bodmer教授惠贈(zèng))量化分析第7 d、第21 d齡果蠅心率和縮短分?jǐn)?shù)。

1.4.3運(yùn)動(dòng)能力檢測用NV-GS400攝像機(jī)(日本Panasonic公司產(chǎn))于果蠅第7 d、第21 d齡拍攝果蠅震落至培養(yǎng)瓶底部后的負(fù)趨地性爬行的行為學(xué)特征,測量攀爬指數(shù)評(píng)定果蠅運(yùn)動(dòng)能力,拍攝時(shí)間為17：00—18：00。每組隨機(jī)取樣100只,分為5管,每管20只,拍攝前,先震落5次,讓果蠅適應(yīng),拍攝時(shí),要求每次果蠅必須全部震落,震落的方法是手動(dòng)。攀爬指數(shù)評(píng)定為:試管底部至綿塞下端預(yù)留18 cm作為果蠅運(yùn)動(dòng)區(qū)域,此運(yùn)動(dòng)區(qū)域由底至上分成1、2、3、4、5、6、7、8、9(區(qū)域相應(yīng)得分為1、2、3、4、5、6、7、8、9分)共9個(gè)區(qū)域。從全部果蠅個(gè)體震落至試管底部后第10 s時(shí)計(jì)算各區(qū)域內(nèi)果蠅個(gè)體數(shù),計(jì)算得分之和為攀爬指數(shù)用來評(píng)定運(yùn)動(dòng)能力[17]。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測結(jié)果析因結(jié)果表明,CG9940基因過表達(dá)的構(gòu)建對(duì)基因表達(dá)水平有影響(P<0.01),運(yùn)動(dòng)對(duì)CG9940基因表達(dá)水平無影響(P>0.05),運(yùn)動(dòng)與構(gòu)建對(duì)該基因表達(dá)無交互作用(P>0.05)。說明CG9940基因在果蠅體內(nèi)成功構(gòu)建過表達(dá)系。

多重比較結(jié)果顯示:過表達(dá)對(duì)照組高于對(duì)照組(P<0.01),過表達(dá)對(duì)照組的過表達(dá)率為155.2%;過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組高于對(duì)照組(P<0.01)、高于運(yùn)動(dòng)組(P<0.01),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組的過表達(dá)率為152.0%;其余各組比較無顯著性差異(圖1)。

注:*表示與對(duì)照組比較P<0.05;**表示與對(duì)照組比較P<0.01;

表3、表5同此

圖1CG9940基因表達(dá)量qRT-PCR檢測結(jié)果

Figure 1.Results of qRT-PCR detection of CG9940

gene expression quantity

2.2幼齡果蠅攀爬指數(shù)和心臟收縮功能檢測結(jié)果析因分析表明:運(yùn)動(dòng)和CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡果蠅心率均無影響(P>0.05),二者無交互作用(P>0.05);運(yùn)動(dòng)和CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡果蠅射血分?jǐn)?shù)有影響(P<0.05),二者無交互作用(P>0.05);運(yùn)動(dòng)和CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡果蠅攀爬指數(shù)均無影響(P>0.05),二者無交互作用(P>0.05)(表2)。

表2　幼齡果蠅心臟功能和攀爬指數(shù)析因分析結(jié)果(P值)

多重比較結(jié)果顯示:與對(duì)照組心率相比,過表達(dá)組、運(yùn)動(dòng)組心率有降低的趨勢(P=0.11,P=0.17),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組心率降低(P<0.05),其余各組比較無顯著性差異;與對(duì)照組射血分?jǐn)?shù)相比,過表達(dá)組、運(yùn)動(dòng)組縮短分?jǐn)?shù)增大(P<0.05,P<0.05),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組縮短分?jǐn)?shù)升高(P<0.01),其余各組比較無顯著性差異;與對(duì)照組攀爬指數(shù)相比,過表達(dá)組、運(yùn)動(dòng)組攀爬指數(shù)有上升的趨勢(P=0.20,P=0.44),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組攀爬指數(shù)增大(P<0.05),其余各組比較無顯著性差異(表3)。

表3　幼齡果蠅心臟功能和攀爬指數(shù)檢測結(jié)果

2.3中齡果蠅攀爬指數(shù)和心臟功能檢測結(jié)果析因分析表明:運(yùn)動(dòng)對(duì)心率有影響(P<0.05),過表達(dá)對(duì)心率無影響(P>0.05),二者無交互作用(P>0.05);運(yùn)動(dòng)和CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡果蠅射血分?jǐn)?shù)有影響(P<0.05),二者無交互作用(P>0.05);過表達(dá)對(duì)攀爬有影響(P<0.05),運(yùn)動(dòng)對(duì)攀爬無影響(P>0.05),二者無交互作用(P>0.05)(表4)。

多重比較結(jié)果顯示:與對(duì)照組心率相比,過表達(dá)組、運(yùn)動(dòng)組心率降低(P<0.05,P<0.05),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組心率降低(P<0.01),其余各組比較無顯著性差異;與對(duì)照組縮短分?jǐn)?shù)相比,運(yùn)動(dòng)組、過表達(dá)組縮短分?jǐn)?shù)增大(P<0.05,P<0.05),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組縮短分?jǐn)?shù)升高(P<0.01),其余各組比較無顯著性差異;與對(duì)照組攀爬指數(shù)相比,運(yùn)動(dòng)組、過表達(dá)組攀爬指數(shù)有上升的趨勢(P=0.083、P=0.099),過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組攀爬指數(shù)增大(P<0.01),其余各組比較無顯著性差異(表5)。

表4　中齡果蠅心臟功能和攀爬指數(shù)析因分析結(jié)果(P值)

表5　中齡果蠅心臟功能和攀爬指數(shù)檢測結(jié)果

從圖2可以看出,CG9940基因過表達(dá)、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練以及二者聯(lián)合能延長果蠅心動(dòng)周期從而減緩心率；通過改變舒張、收縮直徑增大心臟縮短分?jǐn)?shù)[縮短分?jǐn)?shù)=(舒張直徑-收縮直徑)/舒張直徑],提高心臟泵血功能。

圖2　中齡果蠅心動(dòng)圖

3　分析與討論

3.1運(yùn)動(dòng)、UAS/Gal4品系構(gòu)建對(duì)1周齡果蠅CG9940基因表達(dá)水平的影響研究表明，運(yùn)動(dòng)能夠改變運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá),產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)適應(yīng),但不同的運(yùn)動(dòng)方案會(huì)對(duì)基因的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)產(chǎn)生影響[18-19]。通過運(yùn)動(dòng)組與安靜組相對(duì)表達(dá)量比較,以及過表達(dá)組與過表達(dá)運(yùn)動(dòng)組相對(duì)表達(dá)量比較,發(fā)現(xiàn)1周規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)該基因表達(dá)量無影響。筆者推測盡管運(yùn)動(dòng)對(duì)NAD活性能產(chǎn)生影響,但并不一定能影響到NAD合成酶基因的表達(dá),此外,也有可能與這種短期的規(guī)律運(yùn)動(dòng)無法達(dá)到CG9940基因產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的閾值有關(guān)。

此外,關(guān)于UAS/Gal4系統(tǒng)構(gòu)建的原理,是通過雌性UAS-CG9940果蠅與雄性arm-Gal4雜交,CG9940是被調(diào)控基因,位于X染色體上,其插入元素P{Mae-UAS.6.11}在CG9940啟動(dòng)子區(qū)域且方向與CG9940正常轉(zhuǎn)錄方向相同,那么在arm-Gal4誘導(dǎo)下使EP插入?yún)^(qū)域的全身CG9940基因過表達(dá)[15-16]。qRT-PCR結(jié)果證實(shí),在果蠅中構(gòu)建的UAS/Gal4系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)CG9940基因過表達(dá)。

3.2CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡、中齡果蠅心臟節(jié)律、泵血功能運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性的影響Ca2+動(dòng)員調(diào)節(jié)對(duì)心臟自律性以及心肌細(xì)胞的收縮有非常重要的作用,正常心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)過程高度依賴細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流,所以Ca2+是調(diào)節(jié)肌纖維收縮和舒張功能重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子[20]。在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位4期自動(dòng)去極化不變的情況下,閾電位水平上移將加大其與最大復(fù)極點(diǎn)位之間的差距,即自動(dòng)去極化達(dá)到閾電位所需的時(shí)間延長,自律性降低；當(dāng)細(xì)胞外鈣離子濃度升高時(shí),閾電位水平上移,結(jié)果自律性降低[21],故正常鈣離子動(dòng)員對(duì)維持心率自律性非常重要。研究表明,長期耐力運(yùn)動(dòng)能提高心臟自律性,降低安靜時(shí)心率,提高泵血功能,其機(jī)制之一可能與心肌鈣離子調(diào)節(jié)、能量代謝的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)有關(guān)[22-25]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練能夠預(yù)防心室纖顫,其機(jī)制在于耐力訓(xùn)練能改善心室心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員調(diào)節(jié)功能,使心肌復(fù)極化正常。進(jìn)一步研究表明，離心運(yùn)動(dòng)如下坡跑,能夠改善線粒體內(nèi)鈣離子動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié),保持線粒體呼吸鏈正常功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),1周的訓(xùn)練有降低幼齡、中齡果蠅心率的趨勢,但能有效提高果蠅泵血功能,這種結(jié)果的差異可能與訓(xùn)練周期較短有關(guān)，可能與影響心肌節(jié)律的Ca2+動(dòng)員調(diào)節(jié)功能的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)要低于能量代謝的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性有關(guān),但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

NAD能直接參與能量代謝,且間接參與鈣離子調(diào)節(jié)。NAD在CD38和環(huán)化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙攀弓h(huán)腺苷二磷酸核糖 (cyclic ADP-ribose,cADPR),cADPR通過激活蘭尼堿受體(Ryanodine receptor,RyR)通道參與細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放;NAD+在激酶催化下接受ATP的γ-磷酸基團(tuán)形成NADP+,NADP+同樣接受CD38和環(huán)化酶催化生成煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,NAADP)。作為Ca2+動(dòng)員第二信使,NAADP通過二孔通道參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+存儲(chǔ)和釋放。有研究表明,耐力性運(yùn)動(dòng)造成RyR的mRNA水平上調(diào),增加對(duì)鈣離子調(diào)節(jié),而RyR通道的激活離不開cADPR和NAADP作用,二者作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員的重要信號(hào)分子,可見運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的鈣離子調(diào)節(jié)適應(yīng)與NAD有一定聯(lián)系。此外,在心肌細(xì)胞內(nèi),Ca2+出入線粒體產(chǎn)生一個(gè)瞬變的去極化,能促進(jìn)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生NADH,同樣也有利于在呼吸鏈中質(zhì)子泵對(duì)NADH的消耗,提示Ca2+代謝能影響心肌NAD水平。

析因結(jié)果表明,幼齡果蠅的心率不受CG9940基因過表達(dá)影響,過表達(dá)對(duì)縮短分?jǐn)?shù)有顯著影響;過表達(dá)對(duì)中齡果蠅心率、縮短分?jǐn)?shù)均有顯著影響。其原因可能是CG9940基因過表達(dá)導(dǎo)致的機(jī)體NAD適應(yīng),能通過改善能量代謝提高心肌的收縮供能,從而使心臟的泵血能力增強(qiáng);而處于發(fā)育階段的幼齡期果蠅,由于心率較快且不穩(wěn)定,使心臟節(jié)律調(diào)節(jié)對(duì)CG9940基因過表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體的NAD適應(yīng)敏感型不強(qiáng)；中齡果蠅心臟結(jié)構(gòu)功能完善,自律性強(qiáng),使CG9940基因過表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體的NAD適應(yīng)能間接、有效地調(diào)節(jié)心臟節(jié)律。因此,CG9940基因是與心臟節(jié)律、心臟功能相關(guān)的基因。

多重比較結(jié)果表明，無論在幼齡還是中齡,盡管與只運(yùn)動(dòng)或只過表達(dá)果蠅相比,運(yùn)動(dòng)聯(lián)合過表達(dá)模式對(duì)心率降低和泵血功能提高并不明顯,但1周訓(xùn)練后果蠅心率、泵血功能的改善要明顯優(yōu)于野生型非運(yùn)動(dòng)果蠅(圖2),提示在野生型遺傳背景下的果蠅,其心臟自律性和泵血功能的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性弱于在CG9940基因過表達(dá)遺傳背景下的果蠅,其原因在于CG9940基因過表達(dá)和1周訓(xùn)練均對(duì)自律性和泵血功能有提高的趨勢或明顯提高,當(dāng)二者聯(lián)合時(shí),這種趨勢或提高就變得更明顯。其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生有利的NAD適應(yīng)和CG9940基因產(chǎn)生有利的NAD適應(yīng)相互結(jié)合有關(guān)。

3.3CG9940基因過表達(dá)對(duì)幼齡、中齡果蠅攀爬能力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性的影響NAD在能量代謝中發(fā)揮重要作用,在安靜狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)無氧酵解以及有氧氧化產(chǎn)生的氫離子與NAD+形成NADH。NADH通過不同機(jī)制進(jìn)入線粒體,并在其內(nèi)膜上進(jìn)行氧化磷酸化合成ATP,滿足機(jī)體能量代謝需求。在不同的組織細(xì)胞中,線粒體外NADH的跨膜機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)不同,磷酸甘油穿梭系統(tǒng)主要存在于肌肉和腦組織中,蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)在心臟等器官中活躍,無論哪種機(jī)制,細(xì)胞液中NAD+都不會(huì)進(jìn)入線粒體,進(jìn)去的只有氫離子,提示在線粒體內(nèi)外,NAD+會(huì)保持一定的濃度。

研究表明,在爆發(fā)型運(yùn)動(dòng)時(shí),由于無氧酵解系統(tǒng)發(fā)生,在線粒體外會(huì)產(chǎn)生比安靜狀態(tài)下更多的氫離子,導(dǎo)致血液和肌肉中的NADH 含量升高而NAD+水平降低。此外,運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激能增加抑制了NADH 脫氫酶的活性,導(dǎo)致NAD+循環(huán)和ATP合成受阻,能量代謝紊亂可能是導(dǎo)致骨骼肌和心肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的原因之一。而且,氧化應(yīng)激還能提高聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶活性,加快NAD+消耗。在這種情況下,有限的NAD+在線粒體內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)需要更有效率,滿足運(yùn)動(dòng)中能量需求,長期的這種刺激使NAD+產(chǎn)生適應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NAD+含量和活性增加,促進(jìn)能量的供給、轉(zhuǎn)移和利用的能力,適應(yīng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。有研究表明,耐力訓(xùn)練提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力,且觀察到大鼠腓腸肌NAD+含量能維持在一個(gè)穩(wěn)定的高水平。此外,NAD還有與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的作用是其作為一種還原劑,能減少氧化應(yīng)激,保護(hù)細(xì)胞,因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)過程往往或多或少伴隨氧自由基產(chǎn)生,特別是大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基,使細(xì)胞膜遭受攻擊,這是運(yùn)動(dòng)能力降低,產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞的機(jī)制之一。因此,NAD+水平與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練密切相關(guān)。

析因結(jié)果表明，CG9940基因過表達(dá)和1周訓(xùn)練對(duì)幼齡果蠅攀爬能力無明顯影響,同樣1周訓(xùn)練對(duì)中齡果蠅攀爬能力無明顯影響,這可能與處于發(fā)育期果蠅行為特征非?；钴S、攀爬水平相對(duì)較高,以及1周訓(xùn)練的訓(xùn)練周期太短有關(guān),從而導(dǎo)致攀爬水平不足以產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)適應(yīng)；但CG9940基因過表達(dá)對(duì)中齡果蠅攀爬能力有影響,筆者推測在中齡階段,果蠅行為特征相對(duì)成熟穩(wěn)定,CG9940基因過表達(dá)造成機(jī)體的NAD適應(yīng),使個(gè)體能量供給、轉(zhuǎn)移和利用的能力強(qiáng)于野生個(gè)體,有效影響攀爬運(yùn)動(dòng)能力。進(jìn)一步多重比較顯示,無論是幼齡和中齡果蠅,運(yùn)動(dòng)聯(lián)合CG9940基因過表達(dá)攀爬能力明顯比野生型非運(yùn)動(dòng)果蠅強(qiáng),提示在CG9940基因過表達(dá)遺傳背景下,幼齡和中齡果蠅運(yùn)動(dòng)能力的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性強(qiáng)于CG9940基因正常表達(dá)的野生型遺傳背景果蠅,其機(jī)制可能是1周訓(xùn)練造成機(jī)體有利的NAD適應(yīng)與CG9940基因過表達(dá)造成機(jī)體有利的NAD適應(yīng)的相互結(jié)合,使能量代謝、抗氧化和抗疲勞能力增強(qiáng),增加攀爬能力的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激敏感性,加快其運(yùn)動(dòng)適應(yīng)。

4　結(jié)論

果蠅NAD合成酶基因過表達(dá)產(chǎn)生的NAD適應(yīng),能增強(qiáng)幼齡和中齡果蠅心臟泵血功能、心臟自律性、攀爬能力對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的敏感性,產(chǎn)生明顯運(yùn)動(dòng)效益,提示NAD合成酶基因表達(dá)改變可能會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)敏感性產(chǎn)生影響;對(duì)于NAD合成酶基因表達(dá)上調(diào)個(gè)體,早期運(yùn)動(dòng)干預(yù)能更有效降低心臟疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),增強(qiáng)心臟功能和運(yùn)動(dòng)能力。

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The Effect of Overexpression of CG9940 mRNA on Exercise Stress Sensitivity of Cardiac Function and Climbing Ability in Young and Middle-age Drosophilas∥

WEN Dengtai,ZHENG Lan,FENG Yue,NI Liu,WANG Hui,ZHANG Min

Objective: To study the effect of overexpression of NAD synthase gene CG9940 mRNA on the exercise stress sensitivity of cardiac function and climbing ability in young and middle-age drosophila.Methods: For gene overexpression,y[1]w[67c23]P{y[+m8]=Mae-UAS.6.11} CG9940[GG01267]virgin females were crossed toarm-Gal4,andW1118virgin females were crossed to arm-Gal4 for control,F1 progeny virgin females of these two crosses were used as control (C) group,exercise (E) group,overexpression control (OC) group and overexpression-exercise (OE) group,as well as adult group,400 per group.The young group was reared to second days and trained,and the adult group was fed to sixteen days and trained,and then sampled at the 7thday and 21stday after being trained 5 consecutive days.Determination of CG9940 gene expression of mRNA by qRT-PCR,the drosophilas’ heart rate (HR) and fraction shortening (FS) were detected by M-mode,climbing index (CI) for exercise capacity measurement.Results: the overexpression rate of mRNA in the OC group was 155.2%,and the overexpression rate in OE group was 152.0%.In the young group,compared with the C group,the FS of E group and OC group was increased (P<0.05),the CI and FS of OE group were increased (P<0.05 andP<0.01,respectively),and the HR of OE group was decreased (P<0.05),while the other groups showed no significant difference.In the middle-aged group,compared to the C group,the HR of E group were decreased (P<0.05),the FS of E group were increased (P<0.05),the HR of OC group were decreased (P<0.05),and the FS of OC group were increased (P<0.05).The CI and FS of OE group were increased (P<0.01),and the HR of OE group were decreased (P<0.01).There was no significant difference in other groups.Conclusions: The overexpression of NAD synthetase gene mRNA can improve the physical training sensitivity of the climbing ability,automaticity of heart and heart pump function in young and middle-aged Drosophilas,which produces an obvious sports benefit.It suggests that NAD synthase gene polymorphism may produce effect on the susceptibility to exercise,and the early exercise intervention to increase the expression of NAD synthase gene was more likely to experience a lower risk of heart disease,and promote cardiac function and exercise ability.

CG9940 gene; drosophilas;exercise stress sensitivity; cardiac function; climbing ability

2015-09-15；

2015-12-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31071039);教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20134306110009)

文登臺(tái)(1989-),男,湖南株洲人,湖南師范大學(xué)博士研究生，體適能與運(yùn)動(dòng)康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研人員；Tel.:15874029643,E-mail:191729783@qq.com

簡介:鄭瀾(1967-),女,湖南長沙人，湖南師范大學(xué)教授,博士，博士生導(dǎo)師；Tel：(0731)88631351，E-mail:Lanzheng@hunnu.edu.cn

G804

A

1000-5498(2016)03-0080-07

10.16099/j.sus.2016.03.014