陳　佳，　邵鄰相，　麻艷芳，　張璐敏，　曾　杰

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華　321004）

佛手葉揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡與壞死*1

陳佳，邵鄰相，麻艷芳，張璐敏，曾杰

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

研究了佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡與壞死的影響.用單細(xì)胞凝膠電泳、DNA梯度電泳檢測DNA損傷，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和DNA含量的變化，Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白PARP的表達(dá).結(jié)果顯示：200μg/m L佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，彗星頭縮小，熒光強(qiáng)度減弱且染色不均勻，出現(xiàn)彗尾，G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加，PARP蛋白幾乎全部被切割；400μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，DNA梯度條帶明顯，表明大多數(shù)細(xì)胞處于晚期凋亡階段；800μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，無大分子條帶，DNA完全斷裂.表明200μg/mL和400μg/mL佛手葉揮發(fā)油可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，800μg/mL佛手葉揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞壞死.

佛手葉；揮發(fā)油；HeLa細(xì)胞；凋亡；壞死

佛手為蕓香科柑桔屬，具有止咳化痰、疏肝理氣、和胃止痛的功效，是我國重要的抗腫瘤中藥［1］.近年來，佛手揮發(fā)油的抗菌消炎作用被廣泛關(guān)注.王建英等［2］研究發(fā)現(xiàn)，佛手揮發(fā)油具有抗炎消腫的功效.郭衛(wèi)東等［3］研究表明，佛手揮發(fā)油能有效抑制枯草桿菌、大腸桿菌等的增殖.本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，佛手揮發(fā)油可有效抑制體外培養(yǎng)的MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［4］.但目前有關(guān)佛手葉揮發(fā)油抗腫瘤方面的研究較少.魏玉君等［5］研究發(fā)現(xiàn)，佛手葉揮發(fā)油對(duì)Hep3B等6種癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用.本文著重探討了佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡與壞死的影響，為開發(fā)治療腫瘤的天然藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1　材料與方法

1.1佛手葉揮發(fā)油的制備

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［6］.

1.2主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠（EB）購于Sigma公司；Caspase-3抗體、PARP抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗均購自Santa Cruz公司.DNA Ladder試劑盒和ECL試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力檢測

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［6］.應(yīng)用SPSS 19.0軟件計(jì)算IC50值，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測.

1.4單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA損傷

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞6 h，收集細(xì)胞.實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［7］.

1.5DNA梯度電泳檢測DNA斷裂

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞.DNA Ladder試劑盒提取DNA，電泳，拍照.

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞6 h，收集細(xì)胞，預(yù)冷的無水乙醇4℃固定過夜，PI（碘化丙啶）染色.流式細(xì)胞儀檢測，CELL Quest軟件進(jìn)行結(jié)果分析.

例如，教學(xué)《營養(yǎng)要均衡》一課時(shí)，以學(xué)校中學(xué)生身體狀況問卷為基礎(chǔ)，分析描述大部分同學(xué)的胖瘦除了遺傳因素以外，飲食是一個(gè)重要的因素。教師可要求學(xué)生對(duì)照均衡膳食“寶塔”并根據(jù)自身的實(shí)際情況制定相應(yīng)的“生活作息表”或者“健康食譜”，選擇食物均衡身體所需要的營養(yǎng)。并嚴(yán)格督促學(xué)生將自己所制定的健康目標(biāo)運(yùn)用到自身實(shí)踐之中，這樣不僅能培養(yǎng)學(xué)生良好的生活習(xí)慣，還能促使學(xué)生課外活動(dòng)以及生活方式都朝著良性健康的方式轉(zhuǎn)變。

1.7Western Blot檢測蛋白表達(dá)

佛手葉揮發(fā)油處理24 h，收集細(xì)胞，提取總蛋白.SDS（十二烷基硫酸鈉）-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉.一抗、二抗孵育.ECL試劑盒發(fā)光，X-光片曝光，顯影，定影，拍照.

1.8統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異.

圖1　單細(xì)胞凝膠電泳檢測佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞DNA損傷的影響

2　結(jié)果

2.1佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞活力的影響

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，細(xì)胞活力明顯降低.不同劑量的佛手葉揮發(fā)油（31.25，62.50，125.00，250.00，500.00和1 000.00μg/mL）分別處理HeLa細(xì)胞6，12和24 h的IC50值依次為146.50，145.84和101.39μg/mL.增殖抑制率隨藥物作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加而增大.

2.2佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞DNA損傷的影響

由圖1可見：對(duì)照組細(xì)胞DNA未損傷，彗星頭為光滑圓形，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，顏色均一；200 μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，彗星頭明顯縮小，熒光強(qiáng)度較弱，染色不均一，出現(xiàn)彗尾，表明DNA已損傷.

2.3佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞DNA斷裂的影響

由圖2可見：與對(duì)照組相比，不同劑量的佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞均出現(xiàn)DNA梯度條帶；400μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理后條帶最明顯，表明多數(shù)細(xì)胞發(fā)生晚期細(xì)胞凋亡；200μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理后條帶較弱，表明多數(shù)細(xì)胞處于中期凋亡階段，少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡階段；800 μg/mL佛手葉揮發(fā)油使大多數(shù)HeLa細(xì)胞壞死.

2.4流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞凋亡

由圖3可見：對(duì)照組細(xì)胞存在二倍體和四倍體峰，細(xì)胞周期正常；與對(duì)照組相比，200μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量減少，G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加.表明佛手葉揮發(fā)油將細(xì)胞周期停滯于G2/M期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

圖2　DNA梯度電泳檢測佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞DNA斷裂的影響

圖3　流式細(xì)胞儀檢測佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

圖4　佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP表達(dá)的影響

2.5Western Blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

由圖4可見：對(duì)照組和陰性對(duì)照組，PARP蛋白以116 kDa的形式存在；5-氟尿嘧啶組和200 μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，PARP蛋白幾乎完全被切割成89 kDa；400μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，PARP蛋白部分被切割成89 kDa.PARP蛋白的切割失活依賴于Caspase-3的激活.由此表明，佛手葉揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡可能依賴于Caspase介導(dǎo)的PARP途徑.

3　討論

細(xì)胞死亡的2種主要方式為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死.多聚ADP核糖聚合酶（PARP）是一種非組蛋白染色體蛋白質(zhì)，具有保持染色體結(jié)構(gòu)完整的功能，在維持基因組穩(wěn)定和細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮重要的作用.研究表明，當(dāng) DNA受損斷裂時(shí)，PARP被激活，作為DNA損傷的分子感受器先占據(jù)DNA缺口位點(diǎn)，保護(hù)裸露的DNA末端免遭核酸酶水解，此外還引導(dǎo)DNA修復(fù)酶與缺口接觸，進(jìn)行修復(fù)［8］.PARP是凋亡過程中Caspase-3和其他半胱氨酸蛋白酶降解的底物，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期分子標(biāo)志.Caspase-3將PARP剪切成24 kD和89 kD兩種片段，繼而PARP的聚ADP和核糖化作用喪失，導(dǎo)致PARP失活，降解核小體DNA，引起凋亡.大量的研究表明，通過刺激Caspase家族激活，從而裂解其底物PARP，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9-10］.

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，PARP切割失活.彗星電泳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，DNA Ladder梯度條帶明顯.這與張璐敏等［7］研究野艾蒿揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似.表明佛手葉揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是依賴Caspase介導(dǎo)的PARP凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.本實(shí)驗(yàn)中，高劑量（800μg/mL）佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細(xì)胞，由于大量蛋白質(zhì)外泄，很難從培養(yǎng)基中提取出相關(guān)蛋白，因而在Western Blot中未檢測到β-actin和PARP蛋白條帶.

綜上所述，低劑量（200μg/mL）和中劑量（400μg/mL）佛手葉揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡；高劑量（800μg/mL）佛手葉揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞壞死.

［1］農(nóng)東紅，劉威，韋艷梅，等.不同種質(zhì)佛手五種微量元素含量的比較分析［J］.北方園藝，2012（21）：165-166.

［2］王建英，施長春，朱婉萍，等.金華佛手揮發(fā)油抗炎及急性毒性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2004，18（2）：46-48.

［3］郭衛(wèi)東，鄭建樹，鄧剛，等.佛手揮發(fā)油抑菌活性的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2009（8）：103-107.

［4］麻艷芳，邵鄰相，張均平，等.佛手揮發(fā)油對(duì)MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2010（22）：1737-1741.

［5］魏玉君，邵鄰相，麻艷芳，等.佛手葉揮發(fā)油的成分分析及生物活性研究［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，37（3）：329-333.

［6］成文召，麻艷芳，邵鄰相，等.佛手葉揮發(fā)油對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的影響［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，36（3）：331-336.

［7］張璐敏，呂學(xué)維，邵鄰相，等.野艾蒿揮發(fā)油誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡與壞死［J］.中藥材，2013（12）：1988-1992.

［8］王淑榮，申存周.ATP，PARP，Caspase-3與細(xì)胞凋亡和脹亡［J］.中國微循環(huán)，2009，13（6）：638-640.

［9］Benchoua A，Couriaud C，Guegan C，etal.Active caspase-8 translocates into the nucleus of apoptotic cells to inactivate poly（ADP-ribose）polymerase-2［J］.JBiol Chem，2002，277（37）：34217-34222.

［10］Guégan C，Sola B.Early and sequential recruitment of apoptotic effectors after focal permanent ischemia in mice［J］.Brain Research，2000，856（1/2）：93-100.

（責(zé)任編輯薛榮）

Essential oil from fingered citron leaves induces apoptosis or necrosis of HeLa cells

CHEN Jia， SHAO Linxiang， MA Yanfang， ZHANG Lumin， ZENG Jie
（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

Effects of essential oil from fingered citron leaves on apoptosis or necrosis of HeLa cellswere investigated.DNA damagewas detected by single cell gel electrophoresis and DNA agarose gel electrophoresis，cell cycle and DNA content changes were analyzed by flow cytometry assay，the expression of protein PARP was examined by Western Blot analysis.The results revealed that treated with 200μg/mL essential oil from fingered citron leaves，a comet featurewas showed with a very small head and awide tail，the fluorescence intensity reduced with uneven dying，the quantity of G2/M period cells increased，the cleavage of PARPwas inactived.The DNA-Ladder stripe was the brightest which indicated the high percentage of apoptosis occured in 400μg/mL group.There was no obvious stripe in 800μg/mL group as DNA was badly damaged.The results showed that low dose（200μg/mL）and middle dose（400μg/mL）essential oil from fingered citron leaves could induce apoptosis.However，high dose（800μg/mL）essential oil from fingered citron leaves led to necrosis of HeLa cells.

fingered citron leaves；essential oil；HeLa cells；apoptosis；necrosis

R285

A

1001-5051（2016）02-0215-04

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.02.015

*收文日期：2015-04-27；2015-09-17

浙江省科技廳項(xiàng)目（2008C22023）

陳佳（1991-），女，浙江衢州人，碩士研究生.研究方向：細(xì)胞生物學(xué).

邵鄰相.E-mail：shaolinxiang@zjnu.cn