陶云瑩， 王巧晗， 赫　勇， 宮慶禮

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 山東 青島 266003)

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研究簡報

光照強度和溫度對雨生紅球藻生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸積累的影響*

陶云瑩， 王巧晗**， 赫勇， 宮慶禮

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 山東 青島 266003)

本文探討了光照強度和溫度2個生態(tài)因子對雨生紅球藻(Haematococcusplivialis)生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸積累的影響。研究表明，光照強度、溫度及二者交互作用對雨生紅球藻的生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸的積累均有顯著影響(P<0.05)。溫度23℃時，細胞密度隨光照強度的升高呈先上升后下降趨勢，在200μmol/(m2·s)時達到最大值4.9×105個/mL。適當(dāng)?shù)母吖庹諒姸群透邷鼐艽龠M雨生紅球藻中蝦青素和內(nèi)源脫落酸的積累，過高則起抑制作用。培養(yǎng)期間雨生紅球藻中蝦青素和內(nèi)源脫落酸的最大峰值分別為6.266mg/L和322.641ng/g(干重)，且最大峰值均出現(xiàn)于27℃、200μmol/(m2·s)處理組。脫落酸含量的最大值出現(xiàn)在蝦青素快速積累前，且在雨生紅球藻的生活周期中，孢囊形成期的內(nèi)源脫落酸含量最高。本研究所得到的規(guī)律對規(guī)?；囵B(yǎng)雨生紅球藻具有一定的指導(dǎo)意義。

光照強度； 溫度； 雨生紅球藻； 生長； 蝦青素； 內(nèi)源脫落酸

引用格式：陶云瑩， 王巧晗， 赫勇， 等. 光照強度和溫度對雨生紅球藻生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸積累的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 46(8): 28-36.

TAO Yun-Ying, WANG Qiao-Han, HE Yong， et al. Effects of light intensity and temperature on the growth and accumulation of astaxanthin and endogenous abscisic acid (ABA) ofHaematococcusplivialis[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(8): 28-36.

雨生紅球藻(Haematococcusplivialis)是一種淡水單細胞綠藻，隸屬于綠藻門(Chlorophata)團藻目(Volvocales)紅球藻科(Haemetococcaccac)紅球藻屬(Haematococcus)[1]。該藻生活周期復(fù)雜，根據(jù)其細胞形態(tài)及細胞內(nèi)色素比值的不同，大致可以分為營養(yǎng)型細胞生長、孢囊形成、孢囊成熟和萌發(fā)4個時期[2]。當(dāng)受到環(huán)境脅迫時，雨生紅球藻的細胞增殖速率降低，細胞從營養(yǎng)型細胞生長期向孢囊形成期轉(zhuǎn)變，并伴隨著蝦青素的大量積累[3]，蝦青素含量可高達細胞干重的2%～4%，一般為微生物中類胡蘿卜素含量的10～50倍，被公認為自然界中天然蝦青素含量最高的生物，是用來獲取天然蝦青素的理想材料[4]。

蝦青素(Astaxanthin)又稱“蝦黃素”，是一種紅色的類胡蘿卜素酮化物[5]。研究表明，蝦青素具有極高的經(jīng)濟價值，它不僅作為天然著色劑被添加到飼料中，用于鮭魚、三文魚等水產(chǎn)動物及家禽、家畜的飼養(yǎng)[6]，還因具有超強的抗氧化活性被應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)[7]、保健、美容護膚等行業(yè)[8]。因此，利用雨生紅球藻規(guī)?；a(chǎn)蝦青素已成為國際藻類學(xué)研究的熱點之一。

脫落酸(Abscisic acid, ABA)又被稱作植物的“脅迫激素”，是一種植物體內(nèi)存在的具有倍半萜結(jié)構(gòu)的植物內(nèi)源激素，它不僅能調(diào)控植物的生長發(fā)育，還能在干旱、高溫等逆境脅迫中，作為植物的抗逆誘導(dǎo)因子[9]。而雨生紅球藻中蝦青素的快速積累也發(fā)生在脅迫環(huán)境下[10]，因此，我們猜測雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的合成和蝦青素的積累相關(guān)聯(lián)。但目前尚未有人研究過雨生紅球藻中蝦青素積累與內(nèi)源脫落酸的關(guān)系，僅孟春曉等研究添加外源脫落酸能促進雨生紅球藻中蝦青素的積累[11]。

本文主要研究了光照強度、溫度及其交互作用對雨生紅球藻生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸積累的影響，旨在查明雨生紅球藻內(nèi)源脫落酸對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，以及內(nèi)源脫落酸的產(chǎn)生與蝦青素積累之間的關(guān)系，為雨生紅球藻的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 實驗藻種與培養(yǎng)基

雨生紅球藻由中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫提供。實驗所用培養(yǎng)基為MCM培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)方法與實驗設(shè)計

1.2.1培養(yǎng)方法將生長狀態(tài)良好，健康活躍的雨生紅球藻接種至無菌的MCM培養(yǎng)基，置于光生物反應(yīng)器中連續(xù)充氣培養(yǎng)至指數(shù)生長期。實驗將指數(shù)生長期的藻細胞接種至裝有2500mL的無菌MCM培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)，起始密度為1×105個/mL，置于光照培養(yǎng)箱中進行不同的光照強度和溫度的處理，連續(xù)光照且充氣培養(yǎng)16d。

1.2.2實驗設(shè)計根據(jù)預(yù)實驗及目前雨生紅球藻研究的綜合結(jié)果，按L9(34)正交表設(shè)計雙因素3水平實驗，即光照強度為50，200，350μmol/(m2·s)；溫度為23，27，31℃，共9個處理，每個處理下設(shè)3個重復(fù)。從接種藻細胞起，每隔1d取樣測定藻細胞密度、蝦青素、類胡蘿卜素及葉綠素含量，并鏡檢藻細胞形態(tài)變化，每隔3d取500mL藻樣，離心冷凍干燥后測藻細胞干重，并稱取相同質(zhì)量的干藻置于-80℃下冷藏保存，用以測定藻細胞內(nèi)源脫落酸的含量。

1.3 生物量

細胞密度用來表示藻細胞的生長速率，而細胞干重能準確的表示藻細胞的最終生物量，因為不同條件下單個細胞積累的蝦青素含量不同，其質(zhì)量也不同，所以細胞密度和細胞干重可能會出現(xiàn)不同的實驗結(jié)果。因而實驗采用細胞密度和細胞干重2種指標來衡量各處理對雨生紅球藻生長的影響。

1.3.1 細胞密度實驗每隔1d取樣，在光學(xué)顯微鏡下使用血球計數(shù)板進行計數(shù)，每個樣品計數(shù)4次，取平均值。

1.3.2 藻細胞干重定期從各樣品中取500mL的藻液，離心去除上清液后，將沉淀的藻細胞轉(zhuǎn)至已稱重的玻璃器皿中(W1)，并置于冷凍干燥機中冷凍干燥24h，快速稱量冷凍干燥后藻細胞和器皿的總質(zhì)量(W2)，計算出單位體積藻的干重W(g/L)。

1.4 葉綠素a含量的測定

采用分光光度計法[12]，分別測定665和750nm處甲醇提取液的吸光度A665和A750，單位體積雨生紅球藻的葉綠素a含量由下列公式計算:

C葉綠素a=13.9×(A665-A750)×U/V。

式中,C葉綠素a的單位為mg·L-1,U為甲醇體積，V為藻液體積。

1.5 蝦青素含量的測定

采用分光光度計法[13]，測定490nm處二甲基亞砜(DMSO)提取液的吸光度A490，則單位體積雨生紅球藻的蝦青素含量用下列公式計算:

C蝦青素=4.5×A490×Va/Vb。

式中，C蝦青素的單位為mg·L-1，Va為提取液體積，Vb為藻液體積。

1.6 類胡蘿卜素含量的測定

采用分光光度計法[14],分別測定480、645和663nm處丙酮提取液的吸光度A480、A645和A663，則單位體積雨生紅球藻的類胡蘿卜素含量用下列公式計算:

C類胡蘿卜素=(A480+0.144×A663-0.638×A645)×4.6×稀釋倍數(shù)。

1.7 內(nèi)源脫落酸含量的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定內(nèi)源脫落酸的含量[15]，試劑盒從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)購得，按照操作指南進行測定。為了準確表示雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的含量，實驗用冷凍干燥法去除水分后，稱取相同質(zhì)量的藻粉,用來測定內(nèi)源脫落酸含量，單位用ng/g(干重)表示。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對所得的數(shù)據(jù)進行雙因子方差分析(P<0.05表示差異顯著)，結(jié)果差異顯著則進行多重比較(Duncan)。用繪圖軟件Sigmaplot10.0作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1 光照強度和溫度對雨生紅球藻生長的影響

光照強度和溫度對雨生紅球藻細胞密度的影響見表1。光照強度和溫度對雨生紅球藻生長均有極顯著影響(FL=560.43，F(xiàn)T=300.56；P<0.01)，二者的交互作用極顯著(F=125.62，P<0.01)。其中光照強度對雨生紅球藻生長的影響大于溫度的影響。細胞計數(shù)結(jié)果表明，雨生紅球藻在不同的光照強度和溫度處理下，細胞的生長速度明顯不同，且隨時間的推移，各處理組的細胞密度均呈先上升后下降趨勢。由表1可知，雨生紅球藻培養(yǎng)期間，溫度為23℃時，隨光照強度的增加，細胞密度先上升后下降，且在培養(yǎng)的第12天光照強度為200μmol/(m2·s)時，細胞密度最高，最大值為4.9×105個/mL。然而，當(dāng)溫度為27和31℃時，其細胞密度隨光照強度的上升而下降，且在31℃ 350μmol/(m2·s)處理下，出現(xiàn)細胞密度的最小值1.1×105個/mL。

光照強度和溫度對雨生紅球藻細胞干重的影響見圖1。不同光照強度和溫度處理下，雨生紅球藻的最終藻干重差異顯著。如圖1所示，光照強度為50μmol/(m2·s)時，溫度對雨生紅球藻細胞干重的影響差異不顯著(這與細胞密度的實驗結(jié)果不同，因為培養(yǎng)后期蝦青素的積累會對雨生紅球藻最終生物量會產(chǎn)生影響)，而在200和350μmol/(m2·s)的光照處理中，隨著溫度的升高，雨生紅球藻的細胞干重下降明顯。且在23℃ 200μmol/(m2·s)處理下的細胞干重最大，為0.298g/L，在31℃ 350μmol/(m2·s)處理下的細胞干重最小，為0.104g/L。

表1　光照強度和溫度對雨生紅球藻細胞密度的影響

注：同一列中不同的字母(a,b,c)表示經(jīng)過多重檢驗(Duncan)相互之間的差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions.

(不同字母表示處理間的差異顯著。Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions. Vertical bars indicate±SD(n=3).)

圖1光照強度和溫度對雨生紅球藻細胞干重的影響

Fig.1Effects of different light intensity and temperature on the dry weight ofH.plivialis

2.2 光照強度和溫度對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響

雙因子方差分析表明，光照強度和溫度對雨生紅球藻蝦青素的積累影響極顯著(FL=4099.33，F(xiàn)T=7970.98；P<0.01)，二者對蝦青素積累的交互作用也極為顯著(F=10048.23，P<0.01)，其中溫度的影響大于光照強度的影響。不同光照強度和溫度條件下雨生紅球藻中蝦青素的積累見表2。實驗結(jié)果表明，各處理下雨生紅球藻中蝦青素的含量，隨著時間的推移均不斷升高，但不同處理下蝦青素積累的速率明顯不同。如表2所示，雨生紅球藻在200和350μmol/(m2·s)的高光照強度誘導(dǎo)下，從第10天開始快速積累蝦青素，而在低光照強度50μmol/(m2·s)誘導(dǎo)下，培養(yǎng)14d后蝦青素才開始快速積累，且含量較低。此外，溫度為23℃時，雨生紅球藻中蝦青素的含量隨著光照強度的升高而升高，而溫度為27和31℃時，雨生紅球藻中蝦青素的含量隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。實驗中蝦青素含量的最大值出現(xiàn)在27℃ 200μmol/(m2·s)條件下，為6.266mg/L，而蝦青素含量的最小值出現(xiàn)在31℃ 350μmol/(m2·s)條件下，為3.280mg/L。

本實驗還研究了不同光照強度和溫度組合下雨生紅球藻中類胡蘿卜素/葉綠素的比值的變化情況，如表3所示。各個處理下的雨生紅球藻中類胡蘿卜素/葉綠素的比值均隨時間的推移而增大，在31℃ 350μmol/(m2·s)處理下出現(xiàn)最大值，為5.684。此外，類胡蘿卜素/葉綠素的比值表現(xiàn)出和蝦青素積累相似的變化趨勢，即在光照強度為50μmol/(m2·s)的蝦青素積累較慢的3個處理組中，類胡蘿卜素/葉綠素的比值也增加緩慢。

2.3光照強度和溫度對雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸(ABA)含量的影響

雙因子方差分析表明，光照強度和溫度對雨生紅球藻內(nèi)源脫落酸的積累影響極顯著(FL=1127.82，F(xiàn)T=2272.57；P<0.01)，二者對內(nèi)源脫落酸的交互作用也極為顯著(F=2758.94，P<0.01)，其中,溫度影響要大于光照強度的影響。不同光照強度和溫度條件下雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的積累見表4。結(jié)果表明，各個處理組中雨生紅球藻內(nèi)源脫落酸的含量均呈先上升后下降的變化趨勢，即都有一個峰值，但峰值出現(xiàn)的時間不同。如表4所示，雨生紅球藻在200和350μmol/(m2·s)的高光照強度誘導(dǎo)下，內(nèi)源脫落酸含量在第8天出現(xiàn)峰值；在50μmol/(m2·s)低光照強度誘導(dǎo)下，內(nèi)源脫落酸在第12天才達到最大值，且相對含量較低。最大峰值出現(xiàn)在27℃ 200μmol/(m2·s)處理組，內(nèi)源脫落酸含量為322.641ng/g，最小峰值出現(xiàn)在31℃ 350μmol/(m2·s)處理組，內(nèi)源脫落酸含量為138.333ng/g。

表4　光照強度和溫度對雨生紅球藻內(nèi)源脫落酸積累的影響

注：同一列中不同的字母(a,b,c)表示經(jīng)過多重檢驗(Duncan)相互之間的差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions.

如圖2所示，各個處理下雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的含量均在孢囊形成期最高，孢囊成熟期其次，營養(yǎng)型細胞生長期最低。并且在23℃時，內(nèi)源脫落酸的含量隨著光照強度的升高而升高；在27℃時，其含量隨著光照強度的升高呈先上升后下降的趨勢；在31℃時，內(nèi)源脫落酸的含量隨著光照強度的升高而下降。

(圖中橫坐標上的字母是指雨生紅球藻生活周期的3個階段，VC表示營養(yǎng)型細胞生長期，EC表示孢囊形成期，MC表示孢囊成熟期。圖中不同字母表示處理間的差異顯著。The letter of VC、EC、MC respectively mean vegetative cell, immature cyst and mature cyst, which are the different stages in life cycle ofH.plivialis.VC means vegetative cell growth, EC means encystment, MC means maturation. Different letters indicate significance level atP<0.05 among different conditions. Vertical bars indicate ±SD(n=3).)

圖2光照強度和溫度對雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸含量的影響

Fig.2Effects of different light intensity and temperature on the endogenous ABA content ofH.plivialis

3　討論

3.1 光照強度和溫度對雨生紅球藻生長的影響

光照強度和溫度是影響植物生長繁殖的重要環(huán)境因子[16]。首先本實驗在不同溫度條件下，光照強度對雨生紅球藻生長的影響差異顯著。由表1可知，23℃ 處理組中，光照強度為200μmol/(m2·s)時雨生紅球藻細胞密度最大，表明適宜的溫度下，適當(dāng)提高光照強度能促進雨生紅球藻細胞密度的增加，但光照強度過強時，細胞密度將受到抑制。這是由于植物都有一個光合補償點和光合飽和點，在這兩點之間光照強度增加，光合作用加快，反之超過了光合飽和點，就會減弱甚至抑制光合作用。而當(dāng)溫度水平較高(27和31℃)時，雨生紅球藻的細胞密度都在50μmol/(m2·s)的光照條件下最大，隨光照強度的上升而受到抑制。這可能是由于光照強度和溫度的協(xié)同作用所致。如溫度升高增加了高光照強度下微藻對光能的熱耗散，從而降低了通過光合電子傳遞鏈傳遞用于碳同化的光能，表現(xiàn)出微藻生長受抑制[17]。其次，由圖1可知，高溫不利于雨生紅球藻的生長繁殖，這與蔣霞敏等所得的溫度超過30℃將不利于雨生紅球藻生長的研究結(jié)果一致[18]。就光合作用而言，高溫能降低卡爾文循環(huán)的活性，從而阻礙同化產(chǎn)物代謝[19]，且溫度較高時雨生紅球藻的光合放氧速率降下[20]的結(jié)論也可以用來解釋這一現(xiàn)象。實驗還表明，高溫高光的交互作用對雨生紅球藻的細胞密度有顯著的影響，能明顯抑制其生長。尤其是31℃ 350μmol/(m2·s)處理組中的雨生紅球藻，培養(yǎng)期間鏡檢發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)細胞自溶死亡的現(xiàn)象較多，該過程中細胞內(nèi)部色素逐漸消失，內(nèi)含物釋放分解，最后殘存透明的外殼[21]。

實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)23℃ 200μmol/(m2·s)的溫光條件最適宜雨生紅球藻的生長繁殖，細胞密度最大值為4.9×105個/mL。其中最適生長的溫度條件與歐陽琴[22]等報道的24℃相近，表明較低的溫度更有利于雨生紅球藻的生長。實驗中發(fā)現(xiàn)不同溫度下，雨生紅球藻最適生長的光照強度不同，溫度較低的處理組，最適光照強度為200μmol/(m2·s)，而溫度較高的處理組，最適光照強度為50μmol/(m2·s)，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是溫度和光照強度的交互作用所致。已有研究也表明，不同研究結(jié)果得出的雨生紅球藻的最適宜光照強度不同，You等認為80～120μmol/(m2·s)為生長的最適光照強度[23]，而Christoph等則認為低于30μmol/(m2·s)時有利于藻細胞的生長[24]。這也可能是由于實驗藻種的品系不同而造成的。

3.2 光照強度和溫度對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

光照強度和溫度對植物次生代謝產(chǎn)物的積累有很大影響[16]。本實驗不同溫度條件下，光照強度對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響差異顯著。由表2可知，23℃處理組中，光照強度為350μmol/(m2·s)時雨生紅球藻中蝦青素的含量最高；27℃處理組中，200μmol/(m2·s)光照條件下雨生紅球藻中蝦青素的含量最高。這表明適當(dāng)增大光照強度有利于雨生紅球藻中蝦青素的積累，但過高的光照強度則會抑制其合成。這與Harker等的結(jié)論一致，他們認為高光能促進蝦青素的快速積累，但是強度過高可能會導(dǎo)致雨生紅球藻的大量死亡[25]。就光保護學(xué)說而言，藻細胞中蝦青素的產(chǎn)生能保護光合色素免受強光的傷害，從而抵御外界脅迫，但當(dāng)脅迫程度超出其防御范圍細胞就會受到損傷，從而降低蝦青素的產(chǎn)量。這還說明光照強度和溫度的交互作用對雨生紅球藻中蝦青素積累影響顯著。因為溫度越高，藻細胞對光照強度的敏感性越高，如350μmol/(m2·s)的光照強度，能促進23℃下雨生紅球藻中蝦青素的合成，卻對27℃下藻細胞中蝦青素的積累起抑制作用。本實驗藻細胞在27℃ 200μmol/(m2·s)條件下，蝦青素的產(chǎn)量最高，為6.266mg/L。張麗根據(jù)四因素三水平正交試驗，得到2種品系適宜蝦青素積累的條件組合均為：光照200μmol/(m2·s)，NaNO30mg/L，NaCl 2g/L，溫度27℃[26]，與本實驗結(jié)果相契合。我們還發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)奶岣邷囟饶艽龠M蝦青素的合成，但溫度過高也不利于雨生紅球藻中蝦青素的積累。這可能是由于過高的溫度會降低蝦青素合成途徑中關(guān)鍵酶(PSY和CRTR-B)的活性[27]，從而抑制類蝦青素的合成。如實驗中31℃下雨生紅球藻蝦青素的含量普遍較低。

Makio Kobayasi等人在研究雨生紅球藻生活周期中時，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素/葉綠素的比值隨著蝦青素的積累而不斷增大，并可以作為區(qū)別雨生紅球藻生活史階段的有效參數(shù)[2]。他們還指出雨生紅球藻在營養(yǎng)型細胞生長、孢囊形成和孢囊成熟期的類胡蘿卜素/葉綠素的比值分別為0.5、1.0和7.0[28]。本實驗中因培養(yǎng)天數(shù)較短，類胡蘿卜素/葉綠素的比值尚未達到7.0，故以3.0的比值來標志孢囊成熟期的開始。已報道蝦青素和葉綠素的吸光值分別與其含量呈線性關(guān)系，高政權(quán)等曾用類胡蘿卜素/葉綠素的比值衡量水楊酸誘導(dǎo)過程中雨生紅球藻細胞蝦青素含量的變化趨勢[29]。本實驗雨生紅球藻中類胡蘿卜素/葉綠素的比值與蝦青素積累有著相似的變化趨勢。從生理學(xué)角度講，細胞的生理特性與色素的積累有著很強的相關(guān)性[30]。隨著培養(yǎng)時間的推移，培養(yǎng)基中氮元素不斷下降，而氮是葉綠素的組成元素，因而藻細胞中葉綠素的含量會有所下降。而脅迫條件下，藻細胞中光合速率下降及呼吸作用增強導(dǎo)致細胞內(nèi)氧自由基的大量積累，會誘導(dǎo)蝦青素的合成及其他生理反應(yīng)[31-32]，從而導(dǎo)致類胡蘿卜素/葉綠素的比值不斷上升。

3.3光照強度和溫度對雨生紅球藻內(nèi)源脫落酸的影響

研究表明光照強度、溫度及二者的交互作用對雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的積累均有顯著影響。首先不同溫度下，光照強度對雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的積累影響顯著。如圖2所示，在23℃處理組中，光照強度為350μmol/(m2·s)時藻細胞中內(nèi)源脫落酸的含量最高。表明高光照強度能誘導(dǎo)“脅迫激素”內(nèi)源脫落酸的合成。這可能與內(nèi)源脫落酸能應(yīng)對脅迫環(huán)境的作用有關(guān)[9]。其次，本實驗在較高的溫度(27和31℃)處理組中，光照強度過高將減少藻細胞中內(nèi)源脫落酸的合成。實驗中內(nèi)源脫落酸含量的最大值出現(xiàn)在27℃ 200μmol/(m2·s)，為322.641ng/g，最小值出現(xiàn)在31℃ 350μmol/(m2·s)，為138.333ng/g。表明光照強度和溫度的交互作用對藻細胞中內(nèi)源脫落酸的合成影響顯著。另外，實驗發(fā)現(xiàn)不同光照條件下，溫度對雨生紅球藻的內(nèi)源脫落酸含量的影響差異顯著。50μmol/(m2·s)處理組中，溫度為31℃時，雨生紅球藻的內(nèi)源脫落酸含量最高，表明高溫能促進雨生紅球藻中內(nèi)源脫落酸的合成。這與高夕全等的研究結(jié)果一致，他們的研究表明，低溫脅迫和高溫脅迫都能導(dǎo)致稻胚中內(nèi)源脫落酸水平的升高[33]。孫雪研究也表明高溫脅迫下，海洋紅藻龍須菜能通過升高內(nèi)源ABA含量，做出應(yīng)激反應(yīng)來減少逆境對藻體的傷害[34]。

由表4可知，在雨生紅球藻培養(yǎng)過程中，內(nèi)源脫落酸的含量都有一個峰值，但峰值出現(xiàn)的時間不同，低光照組(50μmol/(m2·s))在實驗的第12天出現(xiàn)峰值，而其它處理組(200和350μmol/(m2·s))則在第8天出現(xiàn)峰值。這些差異可能是由不同光溫處理下雨生紅球藻進入同一生活周期階段所需的時間不同引起的。圖2所示，雨生紅球藻不同生活周期中內(nèi)源脫落酸的含量不同，且在蝦青素快速積累前的孢囊形成期含量最高，這與Janat Sarmad等報道的杜氏鹽藻中脫落酸的合成比β-胡蘿卜素的積累早的結(jié)果一致。他們猜測這可能是由于脫落酸參與到β-胡蘿卜素的合成導(dǎo)致[35]。因此我們認為，雨生紅球藻中脫落酸的大量合成對蝦青素的快速積累而言可能是必不可少的前提或是一種必然因素。眾所周知，蝦青素是β-胡蘿卜素的衍生物，已有研究證實，蝦青素合成關(guān)鍵酶β-胡蘿卜素酮化酶(bkt)和β-胡蘿卜素羥化酶(crtR-B)基因的5’端上游側(cè)翼序列中存在脫落酸反應(yīng)元件(ABRE)[36-37]。此外，雨生紅球藻中蝦青素的積累常伴隨著藻細胞體積增大[21]，而Jia等在研究水分脅迫下脫落酸啟動與調(diào)節(jié)的結(jié)果表明，ABA積累的觸發(fā)與細胞體積的改變有關(guān)[38]。因此，作者認為蝦青素積累和內(nèi)源脫落酸合成之間存在一定的必然聯(lián)系，但具體的調(diào)控機理還需進一步的實驗研究。

4　結(jié)語

本實驗研究表明光照強度、溫度和二者的交互作用對雨生紅球藻生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸積累的影響顯著，且內(nèi)源脫落酸的含量的增加總是出現(xiàn)在蝦青素的快速積累的前期，表明內(nèi)源脫落酸水平的升高可能是蝦青素快速合成的誘導(dǎo)因子。利用該結(jié)論可能會加速實現(xiàn)雨生紅球藻中天然蝦青素的規(guī)?；a(chǎn)，這對促進中國蝦青素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

[1]王銘, 李濤, 李愛芬, 等. 光照、溫度和pH對雨生紅球藻光合性的影響[J]. 水生生物學(xué)報, 2009, 33(3): 400-405. Wang Ming, Li Tao, Li Ai-fen, et al. Effects of light intensity, temperature and pH on photosynthetic characters ofHaematococcuspluvialis[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(3): 400-405.

[2]Makio K, Yoshiro K, Toshihide K, et al. Morphological changes in the life cycle of the green algaHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1997, 84(1): 94-97.

[3]梁英, 陳書秀. 溫度對雨生紅球藻葉綠素?zé)晒馓匦约拔r青素含量的影響[J]. 海洋湖沼通報, 2009, 3: 112-120.

Liang Ying, Chen Shu-Xiu. Effects of different temperatures on the chlorophyll fluorescence parameters and astax anthin content ofHaematococcuspluvialis[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2009, 3: 112-120.

[4]魏東, 藏曉南. 大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素的研究進展和產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀[J]. 中國海洋藥物, 2001, 5: 4-8.

Wei Dong, Zang Xiao-nan. Production of natural astaxanthin by mass cultivation ofHaematococcuspluvialis: research advances and current situation of industrialization [J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2001, 5: 4-8.

[5]Lorenz R T， Cysewski G R. Commercial potential forHaematococcusmicroalgae as a natural source of astaxanthin[J]. Trends in Biotechnology, 2000, 18(4): 160-167.

[6]Nelis H J, De Leenheer A P. Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds [J]. Journal of Applied Bacteriology, 1991, 70(3): 181-191.

[7]Chew B P, Park J S. Carotenoid action on the immune response[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134(1): 257-261.

[8]Guerin M, Huntley M E, Olaizola M.Heamatococcusantaxanthin: applications for human health and nutrition[J]. Trends in Biotechnology, 2003, 21(5): 210-216.

[9]郝格格, 孫忠福, 張錄強, 等. 脫落酸在植物逆境脅迫研究中的進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(18): 212-215.

Hao Gege, Sun Zhong-fu, Zhang Lu-qiang, et al. A research overview of the plant resistance to adverse environment by using abscisic acid[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(18): 212-215.

[10]莊惠如, 盧海聲, 陳必鏈, 等. 雨生紅球藻營養(yǎng)細胞的蝦青素累積[J]. 水生生物學(xué)報, 2001, 25(4): 376-380.

Zhuang Hui-ru, Lu Hai-sheng, Chen Bi-lian, et al. Astaxanthin accumulation in vegetative cell ofHaematococcuspluvialis[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2001, 25(4): 376-380.

[11]孟春曉, 高政權(quán). 外源脫落酸(ABA)對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī), 2007, 7: 68-69.

Meng Chun-xiao, Gao Zheng-quan. Effects of exogenous abscisic acid on the astaxanthin accumulation ofHaematococcuspluvialis[J]. Hei Long Jiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2007, 7: 68-69.

[12]Azov Y . Effect of pH on inorganic Carbon Uptake in Algal Cultures[J]. Journal of Applied and Environmental Microbiology, 1982, 43(6): 1300-1306.

[13]Boussiba S, Vonshak A. Aastaxanthin accumulation in the green algaHaematococcuspluvialis[J]. Plant Cell Physiological， 1991(32): 1077-1082.

[14]Goodwin T W, Davies B H. Chemistry and Biochemistry of Plant pigments[M]. America: Academic Press, 1976, 2: 149-155.

[15]陳順欽, 黃璐琦, 袁媛, 等. 光照對黃芩懸浮細胞內(nèi)源激素與有效成分相關(guān)性的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2010, 4: 72-74.

Chen Shun-qin, Huang Lu-qi, Yuan Yuan, et al. Effects of light on the endogenous hormones and the relevance with active ingredient of scutellaria suspensiond[J]. Chinese Joural of Experimental Traditional Medical Formulae, 2010, 4: 72-74.

[16]任長江. 光強對雨生紅球藻生長的影響[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2008, 6: 111-113.

Ren Chang-jiang. Effect of various light intensity on the growth ofHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Henan Normal University ( Natural Science) , 2008, 6: 111-113.

[17]張曼, 曾波, 王明書, 等. 溫度升高對高光強環(huán)境下蛋白核小球藻光能利用和生長的阻抑效應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2007, 27(2): 662-667.

Zhang Man, Zeng Bo, Wang Ming-shu, et al. The temperature elevation suppresses the light enery utilization and growth ofChlolorellapyrenoidosaunder high light intensity conditions[J]. Acta Ecologica Singica, 2007, 27(2): 662-667.

[18]蔣霞敏, 柳敏海, 沈芝葉, 等. 溫度、光照與鹽度對雨生紅球藻誘變株蝦青素積累的調(diào)控[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2005, 6: 714-719.

Jiang Min-xia, Liu Min-hai, Shen Zhi-ye, et al. Effects of temperature , illumination and salinity on astaxanthin accumulation inHaematococcuspluvialisaberrant species[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2005, 6: 714-719.

[19]Jiao J, Grodzinski B. The effect of leaf temperature and photo respiratory conditions on export of sugars during steady-state photo synthesis inSalviassplendons[J]. Plant Physiology, 1996, 111: 169-178.

[20]張寶玉, 李夜光, 李中奎, 等. 溫度、光照強度和pH對雨生紅球藻光合作用和生長速率的影響[J]. 海洋與湖沼, 2003, 5: 558-565.

Zhang Bao-yu, Li Ye-guang, Li Zhong-kui, et al. Effects of temperature, light intensity and pH on photosynthesis and growth rate ofHaematococcuspluvialis[J]. Oceanology and Limnology, 2003, 5: 558-565.

[21]劉建國, 殷明炎, 張京浦, 等. 雨生紅球藻的細胞周期初探[J]. 海洋與湖沼, 2000, 2: 145-150.

Liu Jian-guo, Yin Ming-yan, Zhang Jing-pu, et al. Studies of cell cycle inHaematococcuspluvialis[J]. Oceanology and Limnology, 2000, 2: 145-150.

[22]歐陽琴. 雨生紅球藻的培養(yǎng)及蝦青素的提取[D]. 福州: 福州大學(xué), 2004.

Ou Yang-qin. The Study ofHaematococcusPluvialisCulture Conditions and Astaxanthin Extraction and Purification[D]. Fuzhou： Fuzhou University, 2004.

[23]You C J, Chul W C, Yeoung S Y. Combined effects of light intensity and acetate concentration on the growth of unicellular microalga Haematococcus pluvialis[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 490-495.

[24]Christoph H, Kay G, Marco X, et al. Effect of cultivation parameters on growth and pigment biosynthesis in flagellated cells of Haematococcus pluvialis. [J]. Applied Phycology, 2001, 13: 79-87.

[25]Harker M, Tsavalos A J. Factor responsible for astaxanthin formation in the ChlorphyteHaematococcuspluvialis[J]. Bioresource Technology, 1996, 55(3): 207-214.

[26]張麗. 雨生紅球藻的紫外誘變、抗銨品系篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[D]. 青島: 青島科技大學(xué), 2010.

Zhang Li. UV Mutagenesis, Ammonium-Tolerant Strain Selection and Culture Condition Optimization ofHaematococcusPluvialis[D]. Qingdao: Qingdao University of Science and Technology, 2010.

[27]邱保勝, 劉其芳. 雨生紅球藻培養(yǎng)條件研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報, 1999, 1: 112-118.

Qiu Bao-sheng, Liu Qi-fang. Studies about culture conditions ofHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Hua Zhong Normal University, 1999, 1: 112-118.

[28]M Kobayashi, Y Todoroki, N Hirai, et al. Biological activities of abiscisic acid analogs in the Morphological change of the Green AlgaHaematococcuspluvialis[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998, 85(5): 529-531.

[29]高政權(quán), 孟春曉, 刁英英. 施用水楊酸對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007, 26(7): 377-380.

Gao Zheng-quan, Meng Chun-xiao, Diao Ying-ying. The effect of extraneous salicy acid on astaxanthin in accumulation of algaHaematococcuspluvialis[J]. Fisheries Science , 2007, 26(7): 377-380.

[30]王群, 桑敏, 李愛芬. 雨生紅球藻培養(yǎng)過程中色素動態(tài)變化與光和生理特性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2010, 22(5): 850-854.

Wang Qun, Sang Min, Li Ai-fen. The dynamic change of pigments and photosynthetic physiological characteristics ofHaematococcuspluvialiscultures[J]. Natural Product Research and Development, 2010, 22(5): 850-854.

[31]Hagen G, Braune W. Function aspects of second-way carotenoids inH.pluvialis[J]. Phycology, 1994, 30: 241-248.

[32]秦山, 劉國祥, 胡鄭宇. 斜生柵藻中蝦青素的積累過程及其光和活性變化[J]. 水生生物學(xué)報, 2009, 33(3): 509-515.

Qin Shan, Liu Guo-xiang, Hu Zheng-yu. The accumulation of astaxanthin and the response of photosynthetic activity inscenedesmusobliquus[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(3): 509-515.

[33]高夕全, 夏凱, 周燮. 溫度脅迫對稻胚酯酶同工酶、蛋白質(zhì)和內(nèi)源脫落酸(ABA)水平的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報, 1999, 13(4): 12-16.

Gao Xi-quan, Xia Kai, Zhou Yan. Effects of low and high temperature stress on esterase lsoenzyme and protein and endogenous ABA content in young embryo of rice[J]. Anhui Agricultural Technical Teachers College, 1999, 13(4): 12-16.

[34]孫雪, 蔡西栗, 徐年軍. 海洋紅藻龍須菜對2種逆境溫度脅迫的應(yīng)激生理響應(yīng)[J]. 水生生物學(xué)報, 2013, 37(3): 535-540.

Sun Xue, Cai Xi-li, Xu Nian-jun. Physiological response of marine red algae gracilaria lemaneiformis to two kinds of adverse temperature stress[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(3): 535-540.

[35]Sarmad J, Shariati M, Haghjou M M, et al. Relationship between endogenous abscisic acid and β-carotene synthesis in unicellular green algaDunaliella[J]. American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Scientific, 2007, 2(5): 559-564.

[36]Chunxiao Meng, Changying Teng, Peng Jiang, et al. Cloning and characterization of β-carotene ketolase gene promoter inHaematococcuspluvialis[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37(4): 215-282.

[37]Meng C X, Wei W, Su Z, et al. Characterization of carotenoid hydroxylase gene promoter inHaematococcuspluvialis[J]. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 2006, 43(5): 284-288.

[38]Jia W S , Zhang J H , Liang J S . Initiation and regulation of water deficit-induced abscisic acid accumulation in maize leaves and roots: Cellular volume and water relations. [J]. Journal of Experimental Botany, 2001, 52(355): 295-300.

責(zé)任編輯朱寶象

Effects of Light Intensity and Temperature on the Growth and Accumulation of Astaxanthin and Endogenous Abscisic Acid (ABA) ofHaematococcusplivialis

TAO Yun-Ying, WANG Qiao-Han, HE Yong, GONG Qing-Li

(College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The effects of light intensity and temperature onHaematococcusplivialisgrowth and accumulation astaxanthin and endogenous ABA were determined in this study aimed to a identify the endogenous ABA ofH.plivialisresponding to environmental stress, determine the relationship between the generation of endogenous ABA and astaxanthin accumulation, thus providing a theoretical basis to the large-scale production ofH.plivialis. We picked out the alga at exponential growth phase, inoculated it into 2 500 mL of sterile MCM medium(initial density 1×105cells/mL), cultured the alga under different continuous light intensities and temperatures for 16days with aeration. According to the results of preliminary experiments and the present comprehensive study, we designed a two-factor cross experiment, each experimental factor is divided into three levels, and each processing group is set up three repetitions. The contents of chlorophyll, astaxanthin and carotenoid were determined by spectrophotometry, and the content of endogenous ABA was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the light intensity, temperature and their interaction had significant effects on algal growth and accumulation of astaxanthin and endogenous ABA (P<0.05). At 23 ℃, the cell density showed a downward trend after the first rise with the intensity of illumination increased. When light intensity is 200μmol/(m2·s), the cell density is the largest, and the maximum value is 4.9×105cells/mL. In addition, making an appropriate increase in light intensity or temperature can promote the accumulation of astaxanthin and endogenous ABA, however, the excessive intensity can inhibit them. Experiments explained that the maximum contents of astaxanthin and endogenous ABA were observed at 27 ℃ and 200μmol/(m2·s), which were 6.266 mg/L and 322.64 ng/g(dw), respectively. The results also showed that during the life cycle ofH.plivialis, the highest content of ABA was in immature cysts which appeared earlier than the accumulation of astaxanthin. This observation provided some evidences supporting the utilization of exogenous ABA to promote the accumulation of astaxanthin ofH.plivialis.

light intensity; temperature;Haematococcusplivialis; growth; astaxanthin; endogenous abscisic acid

2014青島世界園藝博覽會植物館海洋展陳項目資助

2015-03-18；

2015-12-10

陶云瑩(1989-)，女，碩士生。E-mail：taoyunying@yeah.net

**通訊作者：E-mail：wangqiaohan@ouc.edu.cn

S917.3

A

1672-5174(2016)08-028-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20150077

Supported by 2014 Qingdao International Horticultural Exposition Showcasing Ocean Plant Museum