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      Trametes sp.LS-10C漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色條件優(yōu)化

      2016-09-07 02:10:27安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心安徽蕪湖241000
      關(guān)鍵詞:介體偶氮染料脫色

      劉 宇,湯 斌,李 松(安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽蕪湖 241000)

      Trametes sp.LS-10C漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色條件優(yōu)化

      劉宇,湯斌?,李松
      (安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽蕪湖241000)

      用栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)酸性鉻藍(lán)K進(jìn)行脫色,得到了LS-10C漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色的最適反應(yīng)條件.在給酶量10 U/m L、p H 4.5、溫度45℃、染料質(zhì)量濃度100 mg/L、ABTS 10μmol/L的條件下反應(yīng)2 h后,酸性鉻藍(lán)K的脫色率達(dá)到79.56%.研究表明,栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶在處理染料廢水脫色領(lǐng)域具有研發(fā)和應(yīng)用前景.

      栓菌;漆酶;偶氮染料;脫色

      有機(jī)合成染料根據(jù)其發(fā)色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)主要分為偶氮類和蒽醌類等,其中,偶氮染料(Azo dyes)是廣泛應(yīng)用于紡織和印染工業(yè)中的第一大類染料[1].偶氮染料是一類含有一個(gè)或者多個(gè)偶氮基團(tuán)(-N=N-)的芳香族化合物,具有致癌、致畸或其他毒性作用[2].在染料的生產(chǎn)和使用過程中,約有10%~15%的染料直接隨廢水一起排出,嚴(yán)重影響著生態(tài)系統(tǒng)的和諧穩(wěn)定.因此,尋求經(jīng)濟(jì)有效的偶氮染料降解或去除方法對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和人類的健康具有重要意義.

      漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是多銅氧化酶家族(Multi-copperoxidases,MCOs)中最重要的一員,1883年由Yoshida在漆樹(Rhus vernicifera)汁液中首次發(fā)現(xiàn)[3-4].漆酶具有較高的氧化還原電勢(shì),可以催化氧化酚類化合物;在某些小分子介體(Mediators)存在的條件下,還能夠氧化非酚類物質(zhì)[5-6].因此,漆酶在木質(zhì)素的去除、紙漿的生物漂白、印染廢水的處理以及環(huán)境保護(hù)中的生物修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛和深入[7].研究發(fā)現(xiàn),漆酶可對(duì)多種偶氮染料進(jìn)行有效脫色,是生物酶法處理印染廢水的常用酶種之一[8-9].

      選擇偶氮染料酸性鉻藍(lán)K利用栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶進(jìn)行脫色處理,研究中考察了小分子介體、漆酶用量、染料質(zhì)量濃度、作用溫度和p H等因素對(duì)該酸性染料脫色率的影響,以期為偶氮染料的生物酶法處理提供參考.

      1 材料與方法

      1.1實(shí)驗(yàn)材料

      (1)菌株.漆酶產(chǎn)生菌株Trametes sp.LS-10C由安徽工程大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(M2015191).

      (2)培養(yǎng)基.PDA培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、土豆浸出汁200 g/L、瓊脂20 g/L、p H自然;種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、p H自然;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15 g/L、豆渣10 g/L、麩皮浸出汁100 g/L、NH4Cl 3.0 g/L、KH2PO41.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.25 g/L、NaCl 1.5 g/L、MgSO41.0 g/L、Tween-80 0.3%、p H自然.

      (3)主要試劑.ABTS[2,2'-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]和DMP(鄰苯二甲酸二甲酯)購自Sigma公司;酸性鉻藍(lán)K(Acid Chrome Blue K,ACBk,λmax=545 nm)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;香蘭素、丁香醛、HOBT(1-羥基苯并三氮唑)、阿魏酸、丁香酸、HBA(對(duì)羥基苯甲酸)等購置于上海源葉生物科技有限公司;其他化學(xué)純或分析純生化試劑購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;麩皮和豆渣,均為市售.酸性鉻藍(lán)K的結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

      (4)主要的儀器設(shè)備.QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱(太倉市華美生化儀器廠);BIOTECH-10JS-9000C自動(dòng)發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司);L5紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司);HH-601A數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);PHSJ-3F雷磁p H計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

      圖1 酸性鉻藍(lán)K的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

      1.2實(shí)驗(yàn)方法

      (1)粗酶液的制備.挑取斜面中培養(yǎng)的Trametes sp.LS-10C菌絲(約3 cm2)接種至種子培養(yǎng)基中(150 m L/500 m L),置于30℃、200 r/min培養(yǎng)48 h后,以10%的接種量轉(zhuǎn)接于10 L自動(dòng)發(fā)酵罐.發(fā)酵條件控制為:裝液量7 L、溶氧30%、溫度30℃、p H自然.發(fā)酵7 d后取發(fā)酵液于4℃、5 000 r/min離心30 min,收集上清液即得粗酶液,置于4℃保存?zhèn)溆?

      (2)漆酶的分離純化[10].

      (3)漆酶活力的測(cè)定.以ABTS為底物[11],將等體積的0.5 mmol/L ABTS溶液與適當(dāng)稀釋的漆酶液置于40℃水浴中反應(yīng),測(cè)定反應(yīng)前3 min內(nèi)反應(yīng)體系在420 nm處吸光值的變化,并且定義1 min內(nèi)氧化1μmol ABTS所需要的酶量為一個(gè)漆酶活力單位(U).其中,ABTS溶液或酶液均使用醋酸—醋酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,p H 4.0)配置或稀釋并以煮沸滅活的酶液作為對(duì)照.已知,420 nm處ABTS的摩爾消光系數(shù)ε420=36 L/(mmol·cm).

      2 結(jié)果與分析

      2.1介體對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      在漆酶催化染料脫色的過程中,介體的參與往往可以顯著提升脫色效率和脫色率[12].因此,研究在酸性鉻藍(lán)K脫色體系中分別加入香蘭素、丁香醛、HOBT、阿魏酸、DMP、丁香酸、HBA和ABTS等介體至終濃度均為10μmol/L,對(duì)照組不添加任何介體,結(jié)果如圖2a所示.由圖2a可知,ABTS對(duì)Trametes sp.LS-10C漆酶催化ACBk脫色有明顯的促進(jìn)作用.ACBk脫色率是對(duì)照組的1.87倍;丁香醛和HOBT對(duì)ACBk脫色的促進(jìn)作用則不明顯,分別是對(duì)照組的1.27倍和1.21倍;其他介體對(duì)于該漆酶催化酸性鉻藍(lán)K脫色的影響較小.因此,選擇ABTS作為LS-10C漆酶對(duì)ACBk脫色研究的最佳介體.

      在反應(yīng)體系中加入不同濃度的ABTS,以研究ABTS濃度對(duì)ACBk脫色的影響,結(jié)果如圖2b所示.由圖2b可知,在沒有ABTS情況下,LS-10C漆酶對(duì)ACBk的脫色率為40.48%;并且該酸性染料的脫色率隨ABTS濃度的增加而增加,最高可達(dá)到80.17%;當(dāng)ABTS濃度高于10μmol/L時(shí),該漆酶對(duì)ACBk脫色率的增加開始趨于平緩.所以,ACBk的脫色反應(yīng)中ABTS的最適加入量為10μmol/L.關(guān)于漆酶/介體對(duì)染料脫色的影響在相關(guān)文獻(xiàn)中也有報(bào)道,如Woodward[13]等研究發(fā)現(xiàn)HBT等介體在Trametes trogii漆酶處理工業(yè)紡織廢水中具有顯著的促進(jìn)作用,但鄰香豆酸等介體則具有強(qiáng)烈的抑制作用.趙敏[14]等研究發(fā)現(xiàn)以TEMPO為介體時(shí)能大大增強(qiáng)疣孢漆斑菌NF-05漆酶對(duì)橙黃G6的脫色效率.

      圖2 介體種類和ABTS濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      2.2給酶量對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      適當(dāng)稀釋Trametes sp.LS-10C漆酶液并分別加入各反應(yīng)體系至不同的終濃度,以研究給酶量對(duì)ACBk脫色的影響,測(cè)定結(jié)果如圖3所示.由圖3可知,隨著給酶量的增加ACBk脫色率也相應(yīng)地得到提高;當(dāng)給酶量增加至10 U/m L時(shí),ACBk脫色率基本接近最大值;繼續(xù)增加漆酶用量時(shí),ACBk脫色率趨于穩(wěn)定.因此,漆酶的最適給酶量為10 U/m L.

      2.3染料質(zhì)量濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      使用緩沖液將ACBk分別稀釋至25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L、150 mg/L、175 mg/L和200 mg/L并進(jìn)行脫色,結(jié)果如圖4所示.由圖4可知,當(dāng)ACBk質(zhì)量濃度從25 mg/L增加至100 mg/L時(shí),ACBk脫色率逐漸上升至73.53%;當(dāng)ACBk質(zhì)量濃度繼續(xù)增大至200 mg/L時(shí),ACBk脫色率基本穩(wěn)定.所以,Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk在100~200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)脫色效果較好.

      圖3 漆酶濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      圖4 染料質(zhì)量濃度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      2.4溫度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      將ACBk脫色體系分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃等一系列溫度下進(jìn)行脫色反應(yīng),以研究脫色溫度對(duì)ACBk脫色的影響,結(jié)果如圖5所示.由圖5可知,在20~45℃之間,Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk脫色率與溫度呈正相關(guān)關(guān)系,45℃時(shí)ACBk脫色率達(dá)到最大值75.37%;當(dāng)脫色溫度繼續(xù)上升,ACBk脫色率隨之下降,在60℃時(shí)該漆酶對(duì)ACBk染料的脫色率下降至66.31%.因此,選擇45℃作為LS-10C漆酶催化ACBk脫色的最適脫色溫度.

      2.5p H對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      用p H分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5、6.5和7.0的緩沖溶液配置ACBk染料并進(jìn)行脫色反應(yīng),以研究p H對(duì)ACBk脫色的影響,結(jié)果如圖6所示.由圖6可知,隨著p H的增加,ACBk脫色率先增加后下降,p H 4.5時(shí)脫色率最大(74.52%);在p H 4.0~5.0范圍內(nèi),ACBk脫色率較高,基本在66%以上;當(dāng)p H在5.0~7.0時(shí),ACBk脫色率迅速下降至28.27%.因此,Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk的最佳脫色p H為4.5.

      2.6酸性鉻藍(lán)K脫色率隨時(shí)間的變化規(guī)律

      根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將ACBk染料的脫色反應(yīng)體系控制在最優(yōu)條件下進(jìn)行,并延長其脫色時(shí)間至24 h,ACBk脫色率隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖7a所示.由圖7a可知,Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk的脫色率隨時(shí)間的延長而增加,24 h時(shí)脫色率最高可達(dá)到83.82%.從整個(gè)反應(yīng)趨勢(shì)可以看出,添加ABTS可以顯著提升ACBk的脫色效率(2 h,79.56%/47.18%);隨著脫色時(shí)間的延長,不添加ABTS使得ACBk脫色率仍然較低(24 h,83.82%/71.93%).上述結(jié)果表明,ABTS不但可以提高Trametes sp.LS-10C漆酶對(duì)ACBk在脫色反應(yīng)前期(0~6.0 h)的催化效率,還可以提高ACBk脫色率.這可能是因?yàn)椋浩崦阜肿訌腁BTS或ACBk得到電子,將氧氣還原為水;ACBk被氧化為很不穩(wěn)定的陽離子自由基后,從而引發(fā)一系列反應(yīng)如發(fā)色基團(tuán)發(fā)生斷裂等,ACBk生色結(jié)構(gòu)的破壞表現(xiàn)為染料顏色的消失或變淡;由于ACBk空間位阻等因素,影響漆酶對(duì)該染料降解效率;小分子介體ABTS轉(zhuǎn)變成陽離子自由基后,具有較高的氧化還原電勢(shì),不但能夠?qū)CBk快速氧化脫色,還可以將漆酶較難單獨(dú)降解的物質(zhì)進(jìn)一步氧化.上述猜想在一系列文獻(xiàn)中得到了進(jìn)一步的佐證,Baldrian[15]認(rèn)為HBT等介體通過促進(jìn)氧氣和漆酶底物之間的電子傳遞進(jìn)程,協(xié)助漆酶將底物氧化.Galai[16]等研究發(fā)現(xiàn)Stenotrophomonas maltophilia AAP56漆酶/ABTS對(duì)活性黑5脫色過程中,漆酶單獨(dú)不能降解的活性黑5的偶氮連接橋部分礦化,檢測(cè)到至少有5種中間產(chǎn)物生成.張瑞景[17]等研究表明Pleurotus sp.N3漆酶/HOBT對(duì)苯胺藍(lán)的脫色可能是因?yàn)樵撊玖系娘@色基團(tuán)C=N斷裂解聚生成3種中間產(chǎn)物.

      分別對(duì)處理24 h后的反應(yīng)體系和對(duì)照樣品進(jìn)行全波長掃描(300~800 nm),結(jié)果如圖7b所示.由圖7b可知,ACBk脫色液在其最大吸收波長處還有明顯的特征吸收峰,表明單獨(dú)使用LS-10C漆酶時(shí)ACBk的降解程度相對(duì)漆酶/ABTS體系較低,這與上述實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果是相符的.

      圖5 溫度對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      圖6 p H對(duì)酸性鉻藍(lán)K脫色的影響

      圖7 ACBk脫色率隨時(shí)間變化曲線和漆酶處理前后ACBk脫色液的吸收光譜圖

      3 結(jié)論

      以染料脫色率為考察指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶催化偶氮染料ACBk脫色條件進(jìn)行了研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,部分介體對(duì)ACBk脫色效率有促進(jìn)作用,而ABTS對(duì)LS-10C漆酶催化ACBk脫色的促進(jìn)作用最高.研究中發(fā)現(xiàn),在漆酶用量10 U/m L、p H 4.5、溫度45℃、染料質(zhì)量濃度100 mg/m L、ABTS 10μmol/L的條件下反應(yīng)2 h后,酸性鉻藍(lán)K的脫色率可以達(dá)到79.56%,展現(xiàn)了Trametes sp.LS-10C漆酶在該類偶氮染料脫色中良好的處理效果,具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價(jià)值.

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      Optimization of Conditions in Decolorization of Acid Chrome Blue K by Laccase from Trametes sp.LS-10C

      LIU Yu,TANG Bin?,LI Song
      (Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation in Anhui Province,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

      Decolorization of acid chrome blue K is conducted with the laccase from Trametes LS-10C.The optimum decolorization conditions of acid chrome blue K catalyzed by laccase from LS-10C are obtained.The results show that the amount of enzyme is 10 U/m L,p H is 4.5,temperature is 45℃,the dye concentration is 100 mg/L,the ABTS concentration is 10μmol/L.Under the optimized conditions,the decolorization rate of acid chrome blue K is 79.56%after 2.0 h.The study suggests that the laccase from Trametes sp.LS-10C has research,development and application prospects in treating dye wastewater decolorization.

      Trametes sp.;laccase;azo dyes;decolorization

      TS193.2

      A

      1672-2477(2016)04-0012-05

      2016-01-10

      安徽省自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(1408085QC61)

      劉宇(1988-),男,山東蘭陵人,碩士研究生.

      作通訊者:湯斌(1954-),男,安徽桐城人,教授,碩導(dǎo).

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