乳酸足球菌精氨酸代謝與瓜氨酸積累

楊怡敏，方芳，周朝暉，陳堅，堵國成*（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫21122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫21122；3.江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫21122；.廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東中山52815）

乳酸足球菌精氨酸代謝與瓜氨酸積累

楊怡敏1，2，3，方芳1，2，3，周朝暉4，陳堅1，2，堵國成*1，2
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；3.江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇無錫214122；4.廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東中山528415）

釀造醬油中氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)瓜氨酸由乳酸足球菌通過精氨酸代謝產(chǎn)生。為了研究醬油中瓜氨酸的積累機制，以分離自醬油成曲的乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE 1120為研究對象，考察不同培養(yǎng)條件（碳源、鹽濃度、氨基酸）對其積累瓜氨酸的影響。結(jié)果表明，高鹽環(huán)境是導(dǎo)致乳酸足球菌積累瓜氨酸的關(guān)鍵因素，碳源的種類及濃度對瓜氨酸的積累也有一定影響，培養(yǎng)基中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸含量對瓜氨酸的積累影響不大。該研究結(jié)果對闡明醬油發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)的積累機制具有重要意義。

醬油；氨基甲酸乙酯；乳酸足球菌；精氨酸脫亞胺酶途徑；瓜氨酸

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，簡稱EC）又稱尿烷、烏拉坦，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）在2002年將氨基甲酸乙酯歸類為第2B組（或可能令人類患癌的物質(zhì)），經(jīng)2007年再次評估后又將其改為第2A組（可能令人類患癌的物質(zhì)）［1］。人體攝入氨基甲酸乙酯后，可通過以下幾條途徑對其進(jìn)行代謝：以尿的形式將5%的氨基甲酸乙酯排出體外；通過肝內(nèi)酯酶的作用，將90%以上的氨基甲酸乙酯分解為乙醇、氨和碳水化合物等（這種途徑是無毒性的）；通過細(xì)胞色素P450的作用，將0.5%左右的氨基甲酸乙酯氧化為乙烯基-氨基-甲酸乙酯，然后形成乙烯基-氨基-甲酸乙酯環(huán)氧化物，這種環(huán)氧化物在體內(nèi)形成DNA加聚物，能破壞DNA雙鏈，最終導(dǎo)致機體癌變；另外，同樣通過細(xì)胞色素P450的作用，能將0.1%左右的氨基甲酸乙酯氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，后者能夠誘導(dǎo)Cu2+調(diào)控的DNA損傷，該種途徑是較為普遍的一種［2］。因此，當(dāng)氨基甲酸乙酯被人體過量持續(xù)攝入時，可能會導(dǎo)致肺癌、肝癌等嚴(yán)重腫瘤疾病，對免疫系統(tǒng)造成極大損害。

氨基甲酸乙酯是某些發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中經(jīng)由微生物代謝產(chǎn)生的可致癌物質(zhì)，醬油中就含有一定量的氨基甲酸乙酯。醬油是一種有著悠久歷史的傳統(tǒng)調(diào)味品，受到世界各地的廣泛歡迎，與人們的日常飲食密切相關(guān)。而醬油中氨基甲酸乙酯的存在可能會導(dǎo)致醬油潛在的不安全性，因此迫切需要了解醬油中氨基甲酸乙酯的形成機制，以便采取相應(yīng)控制措施。

在不同的發(fā)酵食品中，由于原料、參與的微生物以及發(fā)酵工藝等因素的不同，氨基甲酸乙酯的形成機理也各不相同，尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸、焦碳酸二乙酯和氰化物等均可與乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯［3-5］。而在醬油發(fā)酵過程中，氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)是瓜氨酸和乙醇，其中瓜氨酸主要是由醬醪中的乳酸菌經(jīng)由精氨酸脫亞胺酶途徑（Arginine deiminase pathway，簡稱ADI途徑）降解精氨酸產(chǎn)生［6］，該途徑主要涉及3個酶，分別為精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，簡稱ADI），鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（Ornithine transcarbamylase，簡稱OTC），氨基甲酸激酶（Carbamate kinase，簡稱CK），其具體反應(yīng)如下：

在高鹽稀態(tài)醬油的制備過程中，發(fā)酵前期是瓜氨酸的快速生成時期，乳酸足球菌是醬油中生成與積累瓜氨酸的主要微生物［6］。乳酸菌的ADI途徑受到環(huán)境因素的調(diào)控，例如Vrancken等研究發(fā)現(xiàn)，pH、鹽濃度、溫度對Lactobacillus fermentum IMDO 130101的ADI途徑有所影響［7-8］。糖類等涉及能量代謝的物質(zhì)也可能對ADI途徑產(chǎn)生影響［9-10］。在不同的環(huán)境因素下，ADI途徑反應(yīng)產(chǎn)物中瓜氨酸和鳥氨酸的比例也會隨之變化。根據(jù)高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝，以乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE 1120為研究對象，考察不同環(huán)境因素（碳源、鹽濃度、涉及ADI途徑的3種氨基酸）對其精氨酸代謝與醬油中氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)瓜氨酸積累的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

高鹽稀態(tài)醬油樣品，取自廣東某醬油廠；乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE 1120，分離自醬油成曲；MRS培養(yǎng)基，購自英國Oxiod公司；精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸標(biāo)樣，購自上海生工生物工程股份有限公司；CO2氣體，購自江蘇省無錫市新南化學(xué)氣體有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱，三洋公司制造；PHS-3C型酸度計，杭州亞美電子儀器廠制造；1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司制造。

1.3方法

1.3.1測定醬油發(fā)酵過程樣品中糖的種類與含量取醬油廠成曲拌鹽水后的第0、1、4、7天的高鹽稀態(tài)醬油樣品，采用8 000 r/min離心樣品5 min，取上清液。準(zhǔn)確移取3.0 mL上清液至10.0 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，充分搖勻，8 000 r/min對其離心10 min。移取1.0 mL上清液至50.0 mL容量瓶中，氮吹儀吹干后，用超純水稀釋至刻度，取3.0 mL過0.22 μm尼龍濾膜后用于高效陰離子交換色譜分析［11］。

1.3.2不同培養(yǎng)條件對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響從乳酸足球菌甘油管中取菌液劃線至MRS固體培養(yǎng)基，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，挑取單菌落接種至50 mL MRS培養(yǎng)基，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，采用8 000 r/min離心培養(yǎng)液5 min。棄上清液，用pH 7.0的PBS緩沖液洗滌菌體兩次，棄上清液，收集菌體，將菌體加入相應(yīng)的培養(yǎng)體系，充分懸浮后于37℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)開始前取樣品1 mL，培養(yǎng)后定期取樣。

考察不同糖對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響時，培養(yǎng)體系分別為：含有5 g/L精氨酸，不同質(zhì)量濃度葡萄糖（0、2、4、6、8 g/L）的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）；含有5 g/L精氨酸，不同質(zhì)量濃度甘露糖（0、3、6、9、12 g/L），不含葡萄糖的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）；含有5 g/L精氨酸，不同質(zhì)量濃度蔗糖（0、8、16、24、32、40 g/L），不含葡萄糖的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）。培養(yǎng)4 d后取樣用于HPLC分析。

考察NaCl質(zhì)量濃度對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響時，培養(yǎng)體系為含有5 g/L精氨酸的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5），其NaCl質(zhì)量濃度分別為0、10、16、18、20、22 g/dL，培養(yǎng)7 d后取樣用于HPLC分析。

考察額外添加ADI途徑中3種氨基酸對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響時，培養(yǎng)體系分別為：含有18 g/dL NaCl，不同質(zhì)量濃度精氨酸（0、2.5、5、10、20 g/L）的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）；含有18 g/dL NaCl，5 g/L精氨酸，不同質(zhì)量濃度瓜氨酸（0、2.5、5、10、20 g/L）的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）；含有18 g/dL NaCl，5 g/L精氨酸，不同質(zhì)量濃度鳥氨酸（0、1.9、3.8、7.6、15.2 g/L）的MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）。培養(yǎng)7 d后取樣用于HPLC分析。

1.3.3氨基酸的測定待測定樣品的處理方法：采用8 000 r/min離心樣品5 min，取200 μL上清液，加入800 μL三氯乙酸以沉淀蛋白質(zhì)，用0.22 μm水系濾膜對其過濾處理后用于游離氨基酸的測定。游離氨基酸的測定采用高效液相色譜法［12］。

2　結(jié)果與討論

2.1醬醪中糖的種類及含量分析

研究碳源對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響時，主要考察醬醪中糖類物質(zhì)對菌株積累瓜氨酸的影響。由于在高鹽稀態(tài)醬油制備過程中，發(fā)酵前7 d是瓜氨酸的快速積累時期，因此首先對醬油發(fā)酵前7 d醬醪中糖類物質(zhì)的種類及含量進(jìn)行了分析，結(jié)果如表1所示。

表1　高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵前期樣品中糖的種類及含量Table 1　Quantification of sugars in morimi

在醬油前期發(fā)酵過程中，醬醪中主要含有葡萄糖，甘露糖和蔗糖等糖類物質(zhì)。對醬醪進(jìn)行離心處理后，在其上清液中，葡萄糖的質(zhì)量濃度在0～7 g/L，甘露糖的質(zhì)量濃度在0～10 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度最高，在0～38 g/L。

2.2碳源對乳酸足球菌積累瓜氨酸的影響

原料中碳源的種類及含量會影響菌體的生長，也會對菌體的代謝產(chǎn)生一定影響。乳酸菌精氨酸代謝途徑可能會受到碳源等能量物質(zhì)的影響［9-10］，因此考察了發(fā)酵前期醬醪中主要的3種糖類物質(zhì)對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響，結(jié)果如圖1所示。

在不含糖類物質(zhì)時，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率為0.18。隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率也隨之升高，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為8 g/L時，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.35。隨著甘露糖質(zhì)量濃度的升高，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率先升高后下降，在甘露糖質(zhì)量濃度為6 g/L時，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到0.38。隨著蔗糖質(zhì)量濃度的升高，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率亦是先升高后下降，在蔗糖質(zhì)量濃度為24 g/L時，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到0.34。在整個ADI途徑中，由CK催化的反應(yīng)是產(chǎn)能反應(yīng)。在碳源（糖類物質(zhì)）充足的情況下，該步反應(yīng)可能會被抑制，進(jìn)而由OTC催化的反應(yīng)也會受到抑制，瓜氨酸積累量可能會因此上升。

2.3食鹽質(zhì)量濃度對乳酸足球菌積累瓜氨酸的影響

在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中，醬醪中NaCl的質(zhì)量濃度常高達(dá)18 g/dL，高鹽環(huán)境對醬醪中微生物的代謝會產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而可能會對瓜氨酸的積累造成影響。因此，考察了NaCl對乳酸足球菌經(jīng)由ADI途徑積累瓜氨酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

在不同NaCl質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件下，乳酸菌瓜氨酸轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出差異。在無NaCl情況下，乳酸足球菌少量積累瓜氨酸，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率為0.29。隨著NaCl質(zhì)量濃度的升高，乳酸足球菌瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率也隨之升高，在NaCl質(zhì)量濃度為22 g/dL時轉(zhuǎn)化率幾乎達(dá)到100%，即精氨酸全部轉(zhuǎn)化生成為瓜氨酸，而瓜氨酸并未進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成鳥氨酸。換言之，NaCl的存在一定程度上抑制了瓜氨酸向鳥氨酸的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致瓜氨酸的積累。而高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中NaCl質(zhì)量濃度高達(dá)18 g/dL，這一高鹽環(huán)境會導(dǎo)致瓜氨酸的大量積累。

圖2　NaCl質(zhì)量濃度對乳酸足球菌積累瓜氨酸的影響Fig.2　Effect of NaCl on citrulline accumulation by P. acidilactici

2.4精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸對乳酸足球菌積累瓜氨酸的影響

ADI途徑中涉及3種氨基酸的代謝，分別為精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸。這3種氨基酸的質(zhì)量濃度可能影響乳酸足球菌的ADI途徑，進(jìn)而對瓜氨酸積累造成影響。因此，考察了額外添加這3種氨基酸對瓜氨酸積累的影響，結(jié)果如圖3所示。

當(dāng)培養(yǎng)體系精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸質(zhì)量濃度不同時，除在不添加精氨酸，18 g/dL NaCl濃度的MRS培養(yǎng)基中不積累瓜氨酸外，其它培養(yǎng)體系中瓜氨酸轉(zhuǎn)化率差異不大，均大于80%。

圖3　添加3種氨基酸對乳酸足球菌積累瓜氨酸的影響Fig.3　Effect of additions of amino acids on citrulline accumulation by P.acidilactici

3　結(jié)語

本實驗結(jié)果表明，NaCl質(zhì)量濃度是影響乳酸足球菌積累瓜氨酸的一個重要因素。在培養(yǎng)基含有18 g/dL NaCl的培養(yǎng)條件下，乳酸足球菌瓜氨酸對精氨酸的轉(zhuǎn)化率大于80%，只要乳酸足球菌在培養(yǎng)體系中對精氨酸的降解時間夠長，瓜氨酸會大量積累。因此，在高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中，高鹽環(huán)境是導(dǎo)致氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)瓜氨酸積累的一個關(guān)鍵因素。此外，碳源（糖類物質(zhì)）的種類及含量對瓜氨酸積累亦有一定影響，在碳源缺乏時，瓜氨酸轉(zhuǎn)化率較低；隨著碳源含量的升高，瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢。而額外添加精氨酸等3種氨基酸對瓜氨酸積累影響不大。

目前，尚未見有如何降低醬油中氨基甲酸乙酯含量的研究報道。而本研究結(jié)果可為如何調(diào)整高鹽稀態(tài)醬油釀造相關(guān)工藝，以降低氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)，進(jìn)而為減少或控制醬油中氨基甲酸乙酯含量，提供研究思路和理論基礎(chǔ)。

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Arginine Metabolism and Citrulline Accumulation of Pediococcus acidilactici

YANG Yimin1，2，3，F(xiàn)ANG Fang1，2，3，ZHOU Zhaohui4，CHEN Jian1，2，DU Guocheng*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.Guangdong Pearl River Bridge Biological Limited Corporation，Zhongshan 528415，China）

Citrulline，a major precursor of ethyl carbamate in soy sauce，is produced by Pediococcusacidilactici via the arginine deiminase pathway.The effect of cultural conditions to citrulline accumulation of Pediococcus acidilactici BBE 1120 strain isolated from koji was investigated through carbon sources，salt concentration，and amino acids.The mechanism of citrulline accumulation in soy sauce was discussed.The high concentration of NaCl was demonstrated as the key factor to citrulline accumulation of the strain.The types and concentrations of carbohydrates also affected the citrulline accumulation，while insignificant influence was observed with the presence of arginine，citrulline and ornithine.This study is of great importance on the illustration of the accumulation mechanism for ethyl carbamate precursor during soy sauce fermentation.

soy sauce，ethyl carbamate，Pediococcusacidilactici，arginine deiminase pathway，citrulline

Q 93-3

A

1673—1689（2016）03—0247—05

2014-11-25

國家自然科學(xué)基金項目（31371821）；國家973計劃項目（2012CB720802）。

堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事代謝工程、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制等領(lǐng)域的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn