王海　楊志文　孟瀟瀟　徐萍

?

·短篇論著·

Card9在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達(dá)及其意義

王海楊志文孟瀟瀟徐萍

急性胰腺炎(AP)的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，其中“炎癥因子學(xué)說(shuō)”[1]認(rèn)為，巨噬細(xì)胞激活后釋放大量細(xì)胞因子，造成組織損傷加重，進(jìn)而發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)。Card9是巨噬細(xì)胞高表達(dá)的一種新型蛋白，它作為NF-κB、p38MAPK炎癥信號(hào)通路的上游分子，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生、釋放炎癥因子，并在體外巨噬細(xì)胞炎性激活中起至關(guān)重要的作用[2]。本課題組前期臨床結(jié)果顯示，早期AP患者胰腺組織Card9 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加，且與胰腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)[3]。本研究檢測(cè)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織Card9表達(dá)，探討其作用機(jī)制。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：84只健康雄性SD大鼠，鼠齡2～2.5個(gè)月，清潔級(jí)，體重160～200 g，由上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院提供和飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(滬)2009-0086。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。按隨機(jī)表法分成正常組(12只)、假手術(shù)組(36只)、ANP組(36只)。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1 ml/kg體重方法制作ANP模型。假手術(shù)組開(kāi)腹后翻動(dòng)胰腺并以鈍器輕劃胰腺3次后關(guān)腹。制模后3、6、12 h分批處死大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5 ml，注入促凝管中靜置1 h，以3 000 r/min低溫離心10 min分離血清，置液氮保存?zhèn)溆?；觀察胰腺大體病理變化后切取部分胰腺組織置液氮保存，部分胰腺組織用10%甲醛液固定過(guò)夜。正常組大鼠開(kāi)腹后直接抽血、取胰腺組織。

2．檢測(cè)指標(biāo)：(1)血清淀粉酶測(cè)定：由松江中心醫(yī)院檢驗(yàn)科自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。(2)胰腺組織病理檢查：固定胰腺組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理改變，并采用Schimidt等[4]標(biāo)準(zhǔn)從水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血和脂肪壞死程度4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，4個(gè)評(píng)分相加為總評(píng)分。(3)血清TNF-α、IL-1β檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，試劑盒由eBioscience公司提供。(4)Card9 mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)。Card9上游引物5′-TCTTTCGCAGACCCATGACA-3′，下游引物5′-GTCGTATTCCCGTGATCCCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物159 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物187 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。取100 mg液氮固定的胰腺組織，加入1 ml Trizol抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，ΔCt值=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtANP組-ΔCt正常組，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平變化：ANP組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平隨造模后時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，較同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組大鼠均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。假手術(shù)組血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平與正常組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　各組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平變化

注：與同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組比較，aP<0.05

2．胰腺組織病理改變：正常組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)間質(zhì)充血、出血和腺泡細(xì)胞壞死；假手術(shù)組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，絕大部分腺泡小葉完整，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)腺泡細(xì)胞壞死；ANP組大鼠胰腺組織可見(jiàn)腺泡細(xì)胞變性、壞死，小葉結(jié)構(gòu)破壞、間隔增大，細(xì)胞間隙水腫，紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而加重(圖1)。正常組，假手術(shù)3、6、12 h組，ANP 3、6、12 h組大鼠胰腺組織病理評(píng)分分別為(0.65±0.50)、(1.10±0.50)、(1.50±0.85)、(2.00±0.68)、(9.15±1.95)、(11.71.1.01)、(3.35±2.25)分。ANP組較同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而假手術(shù)組與正常組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　正常組(1A)、假手術(shù)組(1B)、ANP 6 h組(1C)大鼠胰腺組織的病理改變(HE　×400)

3．胰腺組織 Card9 mRNA表達(dá)變化：正常組，假手術(shù)3、6、12 h組，ANP 3、6、12 h組大鼠胰腺組織Card9 mRNA表達(dá)量分別為1.0、2.03±0.89、2.50±0.60、4.17±3.54、7.71±4.34、13.35±2.66、23.72±7.67。ANP組較同時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而假手術(shù)組與正常組的差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4．胰腺Card9 mRNA表達(dá)量與胰腺病理評(píng)分及血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平的相關(guān)性：ANP 6、12 h組大鼠胰腺組織Card9 mRNA表達(dá)量與同時(shí)間點(diǎn)的胰腺組織病理評(píng)分及血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平均呈正相關(guān)(6 h時(shí)r值分別為0.898、0.817、0.862、0.721；12 h時(shí)r值分別為0.679、0.849、0.759、0.728，P值均<0.05，圖2、3)。

圖2ANP 6 h組胰腺Card9 mRNA表達(dá)量與血清淀粉酶(2A)、胰腺病理評(píng)分(2B)、血清TNF-α(2C)、IL-1β水平(2D)的相關(guān)性

圖3ANP組12 h時(shí)胰腺Card9 mRNA表達(dá)量與血清淀粉酶(3A)、胰腺病理評(píng)分(3B)、血清TNF-α(3C)、IL-1β水平(3D)的相關(guān)性

討論目前已有文獻(xiàn)[5-7]證實(shí)，Card9在肺結(jié)核、膀胱炎、關(guān)節(jié)炎等感染性疾病發(fā)病機(jī)制中均發(fā)揮重要作用； PPARγ激動(dòng)劑能夠下調(diào)巨噬細(xì)胞Card9蛋白表達(dá)，從而抑制炎癥信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子分泌[8]。但Card9與AP發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，ANP組大鼠血清淀粉酶水平、胰腺病理?yè)p傷及血清TNF-α、IL-1β水平均迅速升高，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加；同時(shí)，胰腺組織Card9 mRNA表達(dá)量也隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，且與血清淀粉酶、胰腺組織病理評(píng)分、血清TNF-α和IL-1β的水平均呈正相關(guān)，表明胰腺組織Card9 mRNA表達(dá)能促進(jìn)TNF-α、IL-1β的分泌，從而加重胰腺炎癥反應(yīng)，與胰腺炎輕重程度成正相關(guān)[9]。

[1]Perides G, Wesis ER, Michael ES, et al. TNF-alpha-dependent regulation of acute pancreatitis severity by Ly-6C(hi) monocytes in mice[J]. J Biol Chem, 2011, 286(15):13327-13335.

[2]Roth S，Ruland J．Caspase recruitment domain-containing protein 9 signaling in innate immunity and inflammation[J]．Trends Immunol，2013，34(6)：243-250.

[3]翁成釗，徐萍，楊志文，等．急性胰腺炎早期胱天蛋白酶募集域蛋白9的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義[J]．中華消化雜志，2015，35(1)：54-56.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1432.2015,01.021.

[4]Schimidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg, 1992, 215(1):44-56.

[5]Dejima T, Shibata K, Yamada H, et al. A C-type lectin receptor pathway is responsible for the pathogenesis of acute cyclophosphamide-induced cystitis in mice[J]. Microbiol Immunol, 2013, 57(12):833-841.

[6]Hsu YM, Zhang Y, You Y, et al. The adaptor protein CARD9 is required for innate immune responses to intracellular pathogens[J].Nat Immunol,2007,8(2)198-205.

[7]Nemeth T, Futosi K, Weisinger J, et al. Card9 mediates autoantibody-induced autoimmune diseases by linking the Syk tyrosine kinase to chemokine production[J]. Annrheumdis, 2013,205124.199.

[8]Kock G, Bringmann A, Held SA, et al. Regulation of dectin-1-mediated dendritic cell activation by peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand troglitazone[J]. Blood, 2011, 117(13):3569-3574.

[9]Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis: from biological basis to clinical evidence[J]. Shock,2007,28(2):130-140.

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.017

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(81370569)

201600上海，南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海松江中心醫(yī)院

徐萍，Email: sjzxxp@yeah.net

2015-07-28)