高紅兵，杜風(fēng)國(guó)，王 歡

(北華大學(xué)林業(yè)與生態(tài)環(huán)境省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132013)

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高效液相色譜法測(cè)定天女木蘭葉中游離酚和結(jié)合酚

高紅兵，杜風(fēng)國(guó)，王 歡

(北華大學(xué)林業(yè)與生態(tài)環(huán)境省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132013)

[目的]進(jìn)一步了解天女木蘭中酚類物質(zhì)種類及含量。[方法]利用高效液相色譜儀對(duì)天女木蘭葉片中游離酚、結(jié)合酚和酯化酚進(jìn)行定性定量測(cè)定。[結(jié)果]在10種檢測(cè)酚中，天女木蘭葉片中含有香豆酸和綠原酸2種游離酚，含有咖啡酸、香豆酸、香豆素和表兒茶素4種結(jié)合酚及香豆素和香豆酸2種酯化酚；各種形式的香豆酸廣泛存在于葉片中。[結(jié)論]該研究建立的高效液相色譜法測(cè)定天女木蘭葉中游離酚和結(jié)合酚的方法準(zhǔn)確、可靠。

高效液相色譜；天女木蘭；游離酚；結(jié)合酚；酯化酚

酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)一種重要的次生產(chǎn)物，其廣泛分布于植物葉、莖、皮、花和果實(shí)等多種器官中，對(duì)植物的葉片顏色、果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)有較大影響。近年來，人們發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)具有清除自由基、抗膜脂質(zhì)氧化、預(yù)防心血管疾病、抗衰老、防癌等功效，越來越引起人們的重視[1-3]；同時(shí)酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)具有抗病、防傷害、抗輻射作用[4]，如咖啡酸、兒茶酚、單寧酸、蘆丁和香豆酸等游離酚參與抗病反應(yīng)[5]。植物抗病性與組織中酚類化合物的含量具有相關(guān)性[6]，酚類化合物能影響細(xì)胞膜透性和 ATP 形成，也能被多酚氧化酶和過氧化物酶催化氧化形成醌類化合物，作為殺菌劑在植物抗病中發(fā)揮重要作用。

天女木蘭(MagnoliasieboldiiK.Koch)又名小花木蘭，為木蘭科木蘭屬的落葉小喬木，其葉片含有大量芳香油及酚類物質(zhì)，是非常具有開發(fā)利用價(jià)值的珍稀野生木本植物資源。有關(guān)木本植物酚類物質(zhì)測(cè)定的研究報(bào)道較多，有氣相色譜法[7]和液相色譜法[8-10]，由于氣相色譜法樣品前處理繁瑣，所以液相色譜法應(yīng)用較多。目前，關(guān)于天女木蘭葉片中游離酚和結(jié)合酚含量的研究鮮見報(bào)道。鑒于此，筆者在前人的HPLC測(cè)定酚類物質(zhì)方法基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了部分改進(jìn)，建立了10種游離酚的定量測(cè)定方法，旨在為天女木蘭的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。 2014年8月，樣品取自吉林省吉林市豐滿區(qū)四六五醫(yī)院成年天女木蘭成株，為完全展開、成熟健康葉片，液氮冷凍，放入-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要儀器。高效液相色譜儀(日本島津公司)，系統(tǒng)配置為 SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AT泵。

1.1.3試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。色譜純甲醇、甲酸和超純水；沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、綠原酸、槲皮素、蘆丁兒茶素、表兒茶素和香豆素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2方法

1.2.1色譜分析條件。色譜柱：C18反相色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相A泵為0.5%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸水溶液，B泵為0.5%甲酸甲醇溶液；總流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；B泵洗脫梯度：起始濃度為10%，15 min時(shí)增加至18%，35 min時(shí)增加到25%，45 min時(shí)增加到35%，再次濃度平衡15 min，60 min時(shí)增加到50%，65 min時(shí)增加到65%，75 min時(shí)增加到95%，隨后流速回落到初始濃度，并且在該濃度平衡分離柱10 min后進(jìn)樣。

1.2.2定性定量測(cè)定。按照“1.2.1”的梯度洗脫條件，先進(jìn)行10種標(biāo)準(zhǔn)游離酚的檢測(cè)，在最大吸收峰下條件利用外標(biāo)曲線法制作各種酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)外標(biāo)曲線計(jì)算出樣品中游離酚的含量。樣品中游離酚的定性采用標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間與其UV圖譜比較確定樣品中酚類物質(zhì)種類。

1.2.3多酚的提取。稱取樣品2 g低溫研磨，加正己烷 20 mL搖床振蕩15 min去酯 2次，加入甲醇-丙酮-水(體積比為7∶ 7∶ 6)提取劑 40 mL，于室溫下超聲20 min 提取3次，抽濾，合并3次抽濾液。濾液用于游離酚和酯化酚的提取，濾渣用于結(jié)合酚的提取。

將上述合并后的抽濾液于 40 ℃ 真空濃縮至水相，用4 mol/L HCl 調(diào)整溶液的 pH至2，離心，取上清液用 80 mL 正己烷去酯 2 次，用80 mL 等體積的乙酸乙酯-無水乙醚混合液萃取 3次，合并萃取液，于 30 ℃ 下真空濃縮至干，用甲醇溶液定容至 5 mL 得游離態(tài)酚，過 0.45 μm 微孔濾膜，供 HPLC 測(cè)定。將上述乙酸乙酯-無水乙醚萃取后所得的水相溶液與離心后沉淀物混合，加入 4 mol/L NaOH 溶液100 mL，于室溫下避光水解 4 h，其余操作同萃取游離酚得到酯化酚，過 0.45 μm 微孔濾膜，供 HPLC 測(cè)定。將甲醇-丙酮-水混合溶劑提取過濾后所得濾渣加入 4 mol/L NaOH 溶液 30 mL，于室溫下避光水解4 h，其余操作同萃取游離酚得到結(jié)合酚。游離酚、酯化酚和結(jié)合酚的提取參照文獻(xiàn)[11]，并略作改動(dòng)。過0.45 μm微孔濾膜，供 HPLC 測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定結(jié)果按照“1.2.1”的色譜條件，10種標(biāo)準(zhǔn)酚的保留時(shí)間和最大峰吸收峰波長(zhǎng)見表1。分離效果色譜見圖1。沒食子酸出峰最早，保留時(shí)間為9.79 min，其他依

表110種酚標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間及最大吸收峰

Table 1Retention time and the maximum absorption wavelength of ten kinds of phenol standards

酚類物質(zhì)Phenolics保留時(shí)間Retentiontime∥min最大吸收波長(zhǎng)Maximumabsorptionwavelength∥nm沒食子酸Gallicacid9.79270兒茶素Catechin24.89278綠原酸Chlorogenicacid31.21327咖啡酸Caffeicacid32.39323表兒茶素Epicatechin36.66278香豆酸Coumaricacid45.23309阿魏酸Ferulicacid50.54322香豆素Coumarin54.13275蘆丁Rutin68.11255槲皮素Quercetin73.04374

次為兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、香豆素、蘆丁和槲皮素，槲皮素最后出峰保留時(shí)間為73.04 min。由于采用梯度洗脫，從75.00 min開始基線開始向上漂移。從分離效果看，8種酚分離效果良好，只有咖啡酸和綠原酸保留時(shí)間相差1.28 min，兩峰相距較近，但不影響定量測(cè)定。

注：1.沒食子酸；2.兒茶素；3.綠原酸；4.咖啡酸；5.表兒茶素；6.香豆酸；7.阿魏酸；8.香豆素；9.蘆?。?0.槲皮素。Note：1.Gallic acid；2.Catechins；3.Chlorogenic acid；4.Caffeic acid；5.Epicatechin；6.Coumaric acid;7.Ferulic acid,8.Coumarin；9.Rutin；10.Quercetin.圖1　10種游離標(biāo)準(zhǔn)酚分離色譜圖譜Fig.1　Chromatogram of ten kinds of the free phenol mixed standard

2.2線性關(guān)系及檢出限由表2可知，10種酚的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，說明在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；綠原酸和蘆丁線性范圍較寬，分別達(dá)0.03～350.00和0.03～370.00 mg/L，而其余8種酚的線性范圍較窄，一般在0.02～100.00 mg/L。綠原酸的檢出限值最低為12.22 μg/L，表兒茶素最高為38.26 μg/L 。

表2　線性回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍及檢出限

2.3回收率按照“1.2.3”酚的提取方法，在空白液中加入標(biāo)準(zhǔn)酚然后提取，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)取平均值。由表3可知，香豆酸回收率最高為95.39%，其次為兒茶素、表兒茶素、阿魏酸、香豆素、蘆丁、槲皮素、咖啡酸和沒食子酸。綠原酸回收率最低為72.43%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.98%～2.49%，說明該提取方法準(zhǔn)確、可靠。

2.4樣品測(cè)定結(jié)果樣品中游離酚、結(jié)合酚和酯化酚的檢測(cè)色譜圖譜與10種標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖譜比較見圖2，利用與標(biāo)樣保留時(shí)間和UV圖譜比較進(jìn)行定性，葉片中含有綠原酸和香豆酸2種游離酚(圖2A)，香豆酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠原酸；葉片中含有結(jié)合態(tài)咖啡酸、表兒茶素、香豆酸和香豆素4種酚，其中結(jié)合態(tài)咖啡酸和香豆酸含量較高(圖2B)；葉片中含有2種形態(tài)酯化酚，香豆酸和香豆素酯化酚(圖2C)。

表3　酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率

由表4可知，葉片中含有2種游離酚、2種酯化酚和4種結(jié)合態(tài)酚。游離酚有香豆酸和綠原酸，香豆酸的含量為5.310 mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠原酸0.750 mg/g的含量；結(jié)合態(tài)咖啡酸含量最高為1.480 mg/g，其次為結(jié)合態(tài)香豆酸含量為1.110 mg/g，結(jié)合態(tài)表兒茶素0.170 mg/g，結(jié)合態(tài)香豆素含量最低為0.014 mg/g；含有香豆素和香豆酸2種酯化酚，香豆酸酯化酚含量為0.570 mg/g，是香豆素酯化酚含量的50余倍。

3　結(jié)論與討論

該研究利用C18反相柱，以0.5%的甲酸水和甲酸甲醇溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，測(cè)定了天女木蘭葉片中酚類物質(zhì)。結(jié)果表明：天女木蘭葉片中含有2種游離酚、4種結(jié)合酚和2種酯化酚；香豆酸普遍存在于3種形態(tài)酚中，在游離酚和酯化酚中香豆酸含量最高；在結(jié)合酚中結(jié)合態(tài)咖啡酸含量最高，其次是香豆酸。

注：A.游離酚；B.結(jié)合酚；C.酯化酚。Note：A.Free phenol；B.Combined phenol；C.Ester phenol.圖2　葉片中游離酚、結(jié)合酚和酯化酚與10種標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的比較Fig.2　Comparison between the free phenol，combined phenol and ester phenol in leaves and ten standard substances

Table 4The determination results of phenolic compounds in leaves mg/g

酚類化合物Phenoliccompound游離酚Freephenoliccompounds酯化酚Esterphenoliccompounds結(jié)合酚Combinedphenoliccompounds沒食子酸Gallicacid000兒茶素Catechol000綠原酸Chlorogrnicacid0.75000咖啡酸Caffeicacid001.480表兒茶素Epicatechin000香豆酸Coumaricacid5.3100.5701.110阿魏酸Ferulicacid000蘆丁Rutin000槲皮素Quercetin000香豆素Coumarin00.0120.014

酚類物質(zhì)的提取通常采用80%甲醇水溶液提取，主要由于甲醇對(duì)大部分游離酚具有良好的溶解性，同時(shí)能抑制酶的活性，防止在提取過程中游離酚被氧化。該試驗(yàn)采用甲醇-丙酮-水(體積比為7∶7∶6)提取，主要是提取游離酚的同時(shí)兼顧提取結(jié)合酚和酯化酚。游離酚中咖啡酸、綠原酸、兒茶素和表兒茶素不穩(wěn)定、易氧化分解，在提取過程中盡量在低溫避光環(huán)境下進(jìn)行，利用旋轉(zhuǎn)薄膜濃縮時(shí)使用40 ℃以下溫度加熱，盡量降低氧化概率。從游離酚的回收率測(cè)定來看，香豆酸回收率最高，達(dá)95.39%，綠原酸回收率最低，為72.43%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.98%～2.49%，表明該提取方法準(zhǔn)確、可靠。

利用HPLC測(cè)定酚類物質(zhì)的報(bào)道較多。念紅麗等[8]利用HPLC測(cè)定了棗皮中12種酚類物質(zhì)含量；孫洪圳等[9]利用HPLC測(cè)定了蘋果樹皮中酚類物質(zhì)；沈丹紅等[10]使用HPLC-MS定性、定量測(cè)定了煙草中25種酚類物質(zhì)。上述研究都采用甲醇和水為流動(dòng)相，外加1%乙酸進(jìn)行梯度洗脫，加入乙酸作用是防止酚類物質(zhì)的羥基和羧基上的氫發(fā)生電離，使酚類物質(zhì)保持不帶電荷狀態(tài)，從而達(dá)到良好的峰型及分離效果[12]。該試驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，采用加入0.5%甲酸，甲酸與乙酸相比分子小、透性較好，可有效減小柱壓。從該試驗(yàn)10種酚的分離效果及峰型看，均取得良好效果。

有關(guān)木本植物酚類物質(zhì)測(cè)定有一些報(bào)道，測(cè)定材料以具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果實(shí)為主，天女木蘭是瀕危樹種，不但具有良好的觀賞性，而且具有一定的藥用價(jià)值。植物體內(nèi)游離咖啡酸、香豆酸和綠原酸具有抗氧化、抑菌和抗病毒作用[13]。它們屬于酚酸類化合物，而且非常不穩(wěn)定，易受外界溫度、酸性和光照等因素影響而發(fā)生降解[14]。該研究發(fā)現(xiàn)，天女木蘭葉片中含有多種酚類物質(zhì)，在10種標(biāo)準(zhǔn)游離酚中檢測(cè)到2種，分別是香豆酸和綠原酸，香豆酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠原酸；含有4種結(jié)合酚分別是結(jié)合態(tài)咖啡酸、結(jié)合態(tài)香豆酸、結(jié)合態(tài)香豆素和結(jié)合態(tài)表兒茶素，結(jié)合態(tài)咖啡酸含量最高達(dá)1.48 mg/g，其次是結(jié)合態(tài)香豆酸含量，結(jié)合態(tài)表兒茶素和香豆素含量較低；酯化酚檢測(cè)到2種分別是香豆素酯化酚和香豆酸酯化酚，后者含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者。天女木蘭葉片中香豆酸含量較高，不論在游離酚和結(jié)合酚和酯化酚中都含有。另外，該研究發(fā)現(xiàn)葉片中結(jié)合態(tài)咖啡酸含量較高，但游離態(tài)咖啡酸未檢出，而葉片中檢測(cè)有游離的綠原酸，未發(fā)現(xiàn)結(jié)合態(tài)綠原酸。木本植物體內(nèi)的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)主要通過醚鍵、縮醛鍵和酯鍵與纖維素結(jié)合廣泛存在于植物細(xì)胞壁中。

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Determination of Free Phenol and Combined Phenol in Leaves ofMagnoliasieboldiiK. Koch by High Performance Liquid Chromatography

GAO Hong-bing, DU Feng-guo, WANG Huan

(Provincial Key Laboratory of Forestry and Ecological Environment, Beihua University, Jilin, Jilin 132013)

[Objective] To further understand the type and content of phenol inMagnoliasieboldiiK. Koch. [Method] High performance liquid chromatography (HPLC) was used to qualitatively and quantitatively measure the free phenol, combined phenol and ester phenol in leaves. [Result] Among the four detected phenol,M.sieboldiileaves contained two free phenols (coumaric acid and chlorogenic acid), four combined phenols (caffeic acid, coumaric acid and catechin, coumarin) and two ester phenols (coumarin and coumaric acid). Various forms of coumaric acid widely existed in leaves. [Conclusion] Detecting free phenol and combined phenol inM.sieboldiileaves by HPLC is accurate and reliable.

HPLC;MagnoliasieboldiiK. Koch; Free phenol; Combined phenol; Ester phenol

吉林省科技廳項(xiàng)目(20140101016JC)；吉林省教育廳項(xiàng)目(吉教合字2014第172號(hào))。

高紅兵(1962- )，男，吉林吉林人，教授，從事植物生理學(xué)研究。

2016-05-03

S 789.4

A

0517-6611(2016)20-004-04