王 重，樊哲儒，張躍強(qiáng)*，李劍峰，高 新

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830091)

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玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及序列分析

王 重1，2，樊哲儒1，2，張躍強(qiáng)1，2*，李劍峰1，2，高 新1，2

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830091；2.農(nóng)業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830091)

[目的]獲得玉米的PEPC基因，并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析。[方法]使用RT-PCR方法由玉米中獲得PEPC全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建克隆載體后進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]獲得的玉米PEPC基因CDS全長(zhǎng)2 913 bp，編碼的多肽鏈包含970個(gè)氨基酸，為疏水性氨基酸，由α-螺旋(61.44%)、無規(guī)則卷曲(34.43%)和延伸鏈(4.12%)組成，定位于細(xì)胞質(zhì)，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，其175～970位氨基酸組成了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能結(jié)構(gòu)域，在173～184、597～609位具有2個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位點(diǎn)。[結(jié)論]該研究克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)基因，它所編碼的氨基酸序列具備PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心區(qū)域。

C4植物；光合作用效率；PEPC；生物信息學(xué)分析

光合作用是作物產(chǎn)量最重要的決定因素之一，作物中90%以上的干重直接來源于光合作用。光合作用效率的高低與作物的產(chǎn)量具有直接的相關(guān)性[1]。但由于光呼吸普遍存在于C3植物，其消耗的光合同化碳素為30%左右，甚至可達(dá)50%～60%[2]，C3植物的光合作用效率相對(duì)較低。Matsuoka 等[3]研究表明，C3植物中光呼吸作用使光合作用效率降低了40%。但陸生植物中95%以上，尤其是水稻和小麥等世界主要糧食作物均為C3植物[4]，利用C4植物中的高效光合基因?qū)3植物的光合效率進(jìn)行改良具有廣闊的應(yīng)用前景。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4光合途徑的關(guān)鍵酶，主要分布于C4植物葉肉細(xì)胞的葉綠體內(nèi)，通過濃縮CO2提高CO2濃度從而為維管束鞘細(xì)胞的C4途徑提供充足的CO2，起到CO2“泵”的作用。研究表明，向C3植物中導(dǎo)入C4途徑關(guān)鍵酶基因能夠使C3植物的光合效率提高[5]。

玉米屬于典型的C4植物，光合作用效率較高。由玉米中克隆PEPC基因并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，能夠?yàn)榻窈罄迷摶蛱岣逤3植物的光合作用效率提供參考。筆者通過RT-PCR方法由玉米中克隆得到PEPC基因，構(gòu)建克隆載體后進(jìn)行測(cè)序并對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1　材料與方法

1.1材料供試材料為玉米(Zeamays)品種SC704，種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所。

1.2試劑Trizol、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α感受態(tài)購(gòu)自TIANGEN公司，M-MLV RTase cDNA試劑盒、ExTaq均購(gòu)自TaKaRa公司，T4DNA連接酶、TA克隆載體pGEM-T Easy購(gòu)自promega公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，測(cè)序服務(wù)由北京華大提供。

1.3方法

1.3.1玉米總RNA提取。在光照充足的中午，取玉米葉片迅速置于液氮中研磨，使用Trizol提取總RNA。提取完成后，參照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit程序合成cDNA。

1.3.2PEPC基因擴(kuò)增。根據(jù)GenBank的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，即P1：5′-AGATCTGCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3′，P2：5′-CTTAAGGGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTT-CTGCAT-3′。PCR反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.3.3PEPC基因克隆測(cè)序。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將得到的目的條帶切下，使用凝膠回收試劑盒回收DNA，然后連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，經(jīng)菌液PCR與酶切鑒定，送北京華大測(cè)序。

1.3.4PEPC序列生物信息學(xué)分析。測(cè)序結(jié)果通過NCBI ORF Finder、BLAST及ProParam程序進(jìn)行在線比對(duì)，確定序列完整編碼框，并對(duì)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用TMHMM和SPORT分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域并預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位；采用ProtScale分析蛋白的疏水性/親水性；利用在線工具 PHD預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；Smart分析該酶的功能結(jié)構(gòu)域；ProtFun分析蛋白質(zhì)功能；最后使用PROSITE分析多肽鏈的催化位點(diǎn)。

2　結(jié)果與分析

2.1玉米PEPC基因的克隆以玉米總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3 kb左右處有特異性條帶(圖1)，與已知PEPC基因的cDNA全長(zhǎng)接近，回收目的片段并構(gòu)建克隆載體進(jìn)行測(cè)序。

圖1　玉米PEPC RT-PCRFig.1　RT-PCR product of Zea mays PEPC cDNA

2.2玉米PEPC基因的核酸與蛋白質(zhì)序列測(cè)序結(jié)果使用Contig Express進(jìn)行拼接，然后在NCBI 上使用ORF Finder查找其開放閱讀框并進(jìn)行BLAST，再利用ProtParam[6]軟件分析其氨基酸序列的理化性質(zhì)。玉米PEPC開放閱讀框的長(zhǎng)度為2 913 bp，GC含量為62.1%；BLAST結(jié)果顯示，核酸序列與玉米PEPC(NM_001111948)最大相似性達(dá)99%；氨基酸序列與玉米PEPC(NP_001105418.1)最大相似性為99%；其編碼的多肽大小為109.31 ku；理論等電點(diǎn)為5.73；含量最高的氨基酸為L(zhǎng)eu、Glu和Ala，不含有Pyl和Sec；負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為137個(gè)，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為119個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)約為44.65，推測(cè)其為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為89.48；親水性系數(shù)為-0.337，推測(cè)玉米PEPC為親水性蛋白質(zhì)。

2.3玉米PEPC跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析TMHMM2.0 Server程序分析表明，玉米PEPC整條肽鏈都位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。使用PSORT對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，其可能定位于細(xì)胞質(zhì)。

2.4玉米PEPC的疏水性/親水性預(yù)測(cè)和分析通過Protscal程序?qū)τ衩譖EPC序列的疏水性/親水性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PEPC整條多肽鏈中親水性氨基酸均勻分布，且多于疏水性氨基酸，絕大多數(shù)氨基酸分值<0。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，即PEPC屬于親水性蛋白，這與其基本理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。表明玉米PEPC中并無明顯的疏水區(qū)，推測(cè)其中可能不存在跨膜蛋白，這也與跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析結(jié)果一致。

圖2　玉米PEPC Protscal分析Fig.2　Analysis of Zea mays PEPC hydropathicity by Protscal

2.5玉米PEPC二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析通過PHD軟件預(yù)測(cè)和分析玉米PEPC氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)[7-9]，結(jié)果見圖3。由圖3可知，玉米PEPC二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(61.44%)、無規(guī)則卷曲(34.43%)和延伸鏈(4.12%)組成，α-螺旋和無規(guī)則卷曲均勻分布于整條肽鏈，而延伸鏈則較為集中地分布于多肽鏈中段。

圖3　玉米PEPC二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3　Forecast of Zea mays PEPC secondary structure by PHD

2.6玉米PEPC功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析使用SMART[10-11]序列分析軟件對(duì)玉米PEPC氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4[7-9]。由圖4可知，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能結(jié)構(gòu)域由位于175～970位的796個(gè)氨基酸組成。使用ProtFun[12]預(yù)測(cè)玉米PEPC的功能，結(jié)果表明，其最主要的功能是參與氨基酸生物合成，此外，還可能參與脂肪酸代謝、蛋白質(zhì)翻譯、輔因子的生物合成以及其他中間代謝過程。

圖4　玉米PEPC功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.4　Analysis of Zea mays PEPC functional domain

2.7玉米PEPCMotifs預(yù)測(cè)和分析利用ScanProsite[6]對(duì)玉米PEPC氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，其在173～184、597～609位氨基酸處具有2個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位點(diǎn)。此外，該多肽鏈還具有13個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase C phosphorylation site)，12個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site)，14個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(N-myristoylation site)，1個(gè)cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)，3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site)，1個(gè)酰胺化位點(diǎn)(Amidation site)(表1)。

表1　玉米PEPC Motifs預(yù)測(cè)

3　討論

與主要糧食作物小麥、水稻等C3植物相比，玉米等C4植物具有CO2補(bǔ)償點(diǎn)低、幾乎無光呼吸等優(yōu)點(diǎn)，尤其是在高溫、干旱、強(qiáng)光等條件下，C4植物具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)及水分利用率[13-14]，同時(shí)兼具較高的水分和氮素利用率以及光合作用效率，干物質(zhì)產(chǎn)量較高[1]。因此，人們一直努力通過各種方式使C3植物具備C4植物的光合特性，以提高其光合作用效率，從而達(dá)到大幅增加產(chǎn)量的目的。以前人們通過C3、C4植物雜交，希望C3植物能夠獲得C4植物同化CO2的高效特性，但效果并未達(dá)到預(yù)期[15]。近幾年隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將C4光合途徑轉(zhuǎn)入C3植物取得了較大突破，在小麥中高粱PEPC基因能夠高效表達(dá)[16]，高粱、玉米的PEPC基因顯著提高了水稻的光合效率[17-18]。但在雙子葉植物煙草中甘蔗和玉米的PEPC基因不能高效表達(dá)[19]，表明C4基因在C3植物中的表達(dá)受種系發(fā)生距離的影響。

在C4光合作用途徑的所有酶中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是最重要的酶之一[20]。在Mn2+或Mg2+存在的情況下，它催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸，然后草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸，同時(shí)釋放出CO2和丙酮酸，丙酮酸再轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。該研究克隆的玉米PEPC基因所編碼的蛋白包含970個(gè)氨基酸，通過SMART對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行功能域分析，結(jié)果表明，該序列175～970位氨基酸組成了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能結(jié)構(gòu)域，且在173～184、597～609位具有2個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位點(diǎn)，推測(cè)其具備磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的催化活性。

人們?cè)贖ydrillaverticillata[21-22]和Bienertiacycloptera(Chenopodiaceae)[23]中進(jìn)一步研究證實(shí)C4循環(huán)和C3循環(huán)能夠在單細(xì)胞內(nèi)完成，表明植物的光合代謝存在多種類型。研究發(fā)現(xiàn)，逆境條件(如鹽害[24]、干旱[25-27]、低溫[28-30]及營(yíng)養(yǎng)脅迫[30]等)會(huì)改變不同類型光合酶在不同作物或不同器官的表達(dá)模式。因此，推斷PEPC除與光合作用直接相關(guān)外，還可能在抗逆生理上發(fā)揮作用。PEPC的功能多效性對(duì)于提高作物光合作用以及抗逆性具有重要意義，有待于進(jìn)一步研究。

[1] 侯愛菊，徐德昌.植物高光效基因育種[J].中國(guó)生物工程雜志，2005，25(9)：19-23.

[2] 張其德，張世平.2，3-環(huán)氧丙酸鉀對(duì)水稻光合功能的改善[J].植物學(xué)報(bào)：英文版，1988，30(1)：54-61.

[3] MATSUOKA M，F(xiàn)URBANK R T，F(xiàn)UKAYAMA H，et al.Molecular engineering of C4photosynthesis[J].Annual review of plant physiology and plant molecular biology，2001，52：297-314.

[4] KU M S B，AGARIE S，NOMURA M，et al.High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants[J].Nature biotechnology，1999，17：76-80.

[5] 李艷，許為鋼，胡琳，等.玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表達(dá)載體構(gòu)建及其導(dǎo)入小麥的研究[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2009，29(5)：741-746.

[6] GASTEIGER E，GATTIKER A，HOOGLAND C，et al.ExPASy：The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis[J].Nucleic Acids Res，2003，31：3784-3788.

[7] 王庭華，鄒曉莉.蛋白質(zhì)理論與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2005：171.

[8] COMBET C，BLANCHET C，GEOURJON C，et al.Network protein sequence analysis[J].TIBS，2000，25(3)：147-150.

[9] GEOURJON C，DELEAGE G.SOPMA：significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments[J].Comput Appl Biosci，1995，11：681-684.

[10] SCHULTZ J，MILPETZ F，BORK P，et al.SMART，a simple modular architecture research tool：Identification of signaling domains[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：5857-5864.

[11] LETUNIC I，DOERKS T，BORK P.SMART 6：Recent updates and new developments[J].Nucleic Acids Res，2009，37：229-232.

[12] JENSEN L J，GUPTA R，BLOM N，et al.Prediction of human protein function from post-translational modifications and localization features[J].J Mol Biol，2002，319(5)：1257-1265.

[13] 羅紅藝.C3植物、C4植物和CAM植物的比較[J].高等函授學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，14(5)：35-38.

[14] 騰勝，錢前，黃大年.C4光合途徑的分子生物學(xué)和基因工程研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9(2)：198-201.

[15] CAMERON R G，BASSETT C L，BOUTON J H，et al.Transfer of C4photosynthetic character through hybridization ofFlaveriaspecies[J].Plant Physiol，1989，90：1538-1545.

[16] CHEN X Q，ZHANG X D，LIANG R Q，et al.Expression of the intact C4typePEPCgene cloned from maize in transgenic winter wheat[J].Chin Sci Bull，2004，49：2137-2143.

[17] XIANG X C，HE L B，SUN J M，et al.Effect of maizePEPCgene in different genetic backgrounds of CMS maintainers and tolerance to photooxidation in the PEPC transgenic line[J].Chin J Rice Sci，2009，23(3)：257-262.

[18] KU M S B，AGARIE S，NOMURA M，et al.High level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants[J].Nat Biotechnol，1999，17：76-8l.

[19] HUDASPETH R L，GRNLA J W，DAI Z Y，et al.Expression on maize phosphoenolpyrnvate carboxylase in transgenic tobacco[J].Plant Physiol，1982，98：458-464.

[20] 趙艷，陳麗梅，李昆志.C4光合作用關(guān)鍵酶PEPC的反應(yīng)機(jī)制[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(23)：6113-6114，6118.

[21] RAO S K，MAGNIN N C，REISKIND J B，et al.Photosynthetic and other phosphocnolpyruvate carboxylase isoforms in the single-cell，facultative C(4)system ofHydrillaverticillata[J].Plant Physid，2002，130(2)：876-886.

[22] MAGNIN N C，COOLEY B A，REISKIND J B，et al.Regulation and localization of key enzymes during the induction of Kranz-lesa，C4type photosynthesis inHydrillaverticillata[J].Plant Phyid，1997，115：1681-l689.

[23] VOZNESEUSKAYA E V，F(xiàn)RANEESCHI V R，KIIRATS O，et al.Proof of C4photosynthesis without Kranz anatomy inBienertiacycloptera(Chenopodiaceae)[J].Plant J，2002，31：649-662.

[24] CUSHMAN J C，MEYER G，MICHALOWSKI C B，et al.Salt stress leads to differential expression of two isogenes of phosphocnolpyruvate carboxylase during Crasulacean acid metabolism induction in the common ice plant[J].Plant cell，1989，1：715-725.

[25] FONTAINE V，CABANE M，DIZENGREMD P.Regulation of phosphocnolpyravate carboxylase inPinushalepensisneedles submitted to ozone and water stress[J].Physid Plant，2003，117(4)：445-452.

[26] HUO S P，YAN Q J，SONG G Y，et al.Progress in morphological and physiological and biochemical indexes of drought resistance[J].Agricultural research in the arid areas，1995，13(3)：67-73.

[27] JEANNEAU M，GERENTES D，F(xiàn)OUEALASEAR X，et al.Improvement of drought tolerance in maize：Towards the functional validation of theZm-Asrlgene and increase of water use efficiency by over-expressing C4-PEPC[J].Biochimie，2002，84(11)：1127-1135.

[28] NAIDU S L，MOOSE S P，AL-SHOAIBI A K，et al.Cold tolerance of C4photosynthesis inMiscanthus×Giganteus：Adaptation in amount sand sequence of C4photosynthetic enzymes[J].Plant Physid，2003，132(3)：1688-1697.

[29] KUBIEN D S，VON CAEMMERER S，F(xiàn)URBANK R T，et al.C4photosynthesis at low temperature.A study using transgenie plants with reduced amounts of Rubisco[J].Plant Physiol，2003，132(3)：1577-1585.

[30] GONZALEZ M C，SANEHEZ R，CEJUDO F J.Abiotic stresses affecting water balance induce phosphocnolpyruvate carboxylase expression in roots of wheat seedlings[J].Planta，2003，216(6)：985-992.

Cloning and Bioinformatics Analysis of Phosphoenolpyruvate Carboxylase(PEPC) in Maize

WANG Zhong1,2, FAN Zhe-ru1,2, ZHANG yue-qiang1,2et al

(1. Institute of Nuclear and Biological Technologies, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi, Xinjiang 830091; 2. Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in Desert Oasis Region, Ministry of Agriculture, Urumqi, Xinjiang 830091)

[Objective] To clone the phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene obtained fromZeamaysand analyze it by bioinformatics. [Method] Primarily, the cDNA clone was constructed by RT-PCR amplified with the gene specific primers, then positive clones were sequenced and analyzed by bioinformatics. [Result] The electrophoresis showed that the coding sequence(CDS) ofPEPCgene inZeamayswas 2 913 bp and the polypeptide chains coded byPEPCincluded 926 amino acids, which were hydrophobic amino acids consists of-helix (61.44%), random coil (34.43%) and extended strand (4.12%), with located in the cytoplasm. There was no transmembrane domain. The 175-970 amino acid composition the functional domains of phosphoenolpyruvate carboxylase, in 173-184; 597-609 bits had two phosphoenolpyruvate carboxylase active site with pyruvate orthophosphate dikinase basing on amino acids sequences comparison. [Conclusion] The PEPC gene in Zea mays has been obtained and the amino acids sequence coded by the gene was conserved and contained active catalyst central site of PEPC.

C4plant; Photosynthetic efficiency;PEPC; Bioinformatics analysis

新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目(xjnkq-2013025)。

王重(1982- )，男，陜西長(zhǎng)安人，助理研究員，碩士，從事小麥遺傳育種工作。*通訊作者，副研究員，博士，從事小麥遺傳育種工作。

2016-06-14

S 188

A

0517-6611(2016)20-114-04