云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交子代胚胎發(fā)育及仔稚幼魚形態(tài)觀察

吳水清，鄭樂云*，黃種持，仇登高，許朝輝，鄭君飄，邱峰巖，吳精靈，劉銀華

(1.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.廈門小嶝水產科技有限公司，福建 廈門 361000)

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云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交子代胚胎發(fā)育及仔稚幼魚形態(tài)觀察

吳水清1，鄭樂云1*，黃種持1，仇登高1，許朝輝1，鄭君飄2，邱峰巖2，吳精靈1，劉銀華1

(1.福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.廈門小嶝水產科技有限公司，福建 廈門 361000)

對云紋石斑魚(♀)與鞍帶石斑魚(♂)雜交子代胚胎及仔稚幼魚的生長發(fā)育進行了觀察與研究。在水溫(22±1)℃、鹽度33、pH7.8的海水中，雜交受精卵經過35h23min完成整個胚胎發(fā)育。胚胎發(fā)育可分為卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期和器官形成期，其中在卵裂期、囊胚期和仔魚出膜前后，雜交子代胚胎的死亡率較高。雜交石斑魚的孵化率為91.5%，低于對照組的93.1%；畸形率為10.5%，高于對照組的5.3%。根據雜交子代卵黃囊消失與否、第二背鰭棘和腹鰭棘的生長與收縮、體色和鱗片的出現，可將雜交石斑魚胎后發(fā)育分為：前期仔魚(03日齡)、后期仔魚(427日齡)、稚魚期(2845日齡)、幼魚期(46日齡以后)；通過與其親本早期發(fā)育進行比較發(fā)現，云紋石斑魚(♀)與鞍帶石斑魚(♂)雜交子代具有一定的雜交優(yōu)勢。

云紋石斑魚；鞍帶石斑魚；雜交子代；胚胎發(fā)育；形態(tài)觀察

云紋石斑魚(Epinephelus moara)和鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)都隸屬于鱸形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)，石斑魚屬。云紋石斑魚俗稱草斑或真油斑，主要分布在日本、韓國和中國沿岸[1]。鞍帶石斑魚俗稱龍躉、龍膽石斑魚，是石斑魚類群中體型最大的魚類，主要產于東南亞、大洋洲海域，在中國的南海也可捕撈到，但是數量稀少[2-5]。云紋石斑魚和鞍帶石斑魚都是肉食性魚類，是具有較高營養(yǎng)價值的名貴海產魚類，也是中國華南沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖種類之一[6-7]。

近年來雜交育種作為海水魚類新品種選育的有效方法，也被廣泛地用于石斑魚新品種培育。目前國內外科研工作者已進行人工雜交的石斑魚種類有：云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(E.septem faciatus)(♂)[8]、 斜帶石斑魚(E.coioides)(♀)×赤點石斑魚(E.akaara)(♂)[9]、 巨石斑魚(E.tauvina)(♀)×赤點石斑魚(♂)[10]、 地中海石斑魚(E.costae)(♀)×東大西洋石斑魚(E.marginatus)(♂)[11]、 棕點石斑魚(E.fuscoguttatus)(♀)×鞍帶石斑魚(♂)[12]、 斜帶石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)[12-13]、 云紋石斑魚(♀)×赤點石斑魚(♂)[7，14]。

本研究對云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交子代早期胚胎發(fā)育及仔稚幼魚發(fā)育過程中的形態(tài)變化特征進行較為系統(tǒng)的觀察。旨在為石斑魚新品種的選育提供參考，豐富雜交石斑魚基礎生物學文庫，并為實現雜交石斑魚規(guī)?；B(yǎng)殖提供科學依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

實驗于2015年4月至6月在廈門小嶝水產科技有限公司進行，實驗所用的云紋石斑魚和鞍帶石斑魚均取自經馴養(yǎng)的野生石斑魚親魚，馴養(yǎng)時間為2～3年。親魚經注射促黃體激素釋放激素(LHRH-A3)和人類絨毛膜促性腺激素(HCG)促熟、催產，對成熟的雌性云紋石斑魚與雄性鞍帶石斑魚進行人工授精(干受精法)，得到的受精卵(云紋石斑魚♀×鞍帶石斑魚♂)作為實驗組；對成熟的云紋石斑魚進行人工授精(干受精法)，所得受精卵(云紋石斑魚♀×云紋石斑魚♂)作為對照組。

1.2雜交受精卵的孵化及仔稚幼魚的培育

將收集到的受精卵放入圓形孵化桶中孵化直至仔魚孵出，期間要定時換水(8h換水一次，每次換水量為50%)，孵化時水溫為(22±1)℃，鹽度33，pH7.8；待仔魚孵出后，將仔魚移入幼苗培育池中培育，水溫(24±1)℃，鹽度33，pH7.8。仔魚開口后投喂牡蠣受精卵，連續(xù)投喂3d，之后開始投喂輪蟲，17d后補充投喂鹵蟲無節(jié)幼體，20d后補充投喂橈足類和大鹵蟲，30d后以投喂橈足類和大鹵蟲為主，并根據各階段幼體生長狀況、存活數量和育苗池中生物餌料的存量，調整橈足類和大鹵蟲的投喂量和投餌次數，培育水體中每天補充小球藻。

1.3胚胎發(fā)育和仔稚幼魚的形態(tài)觀察

在孵化桶中每次隨機取50cell受精卵，用NikonE200顯微鏡進行胚胎發(fā)育的連續(xù)觀測和顯微拍照，并詳細記錄受精卵發(fā)育過程的時間和發(fā)育特征，實驗組和對照組均采用相同的操作方法。25日齡之前每天取樣，26～50日齡每隔2天取樣一次，50日齡之后每隔5天取樣一次，每次均隨機取樣30尾。在NikonE200顯微鏡和OlympusSZX7解剖鏡下觀察雜交斑早期的形態(tài)發(fā)育，并拍照。

1.4數據處理

雜交斑胚胎和仔稚幼魚的可量性狀數據均用Image-Proexpress5.1 軟件采集分析，所得數據進行單因素方差分析，數據以平均值±標準差(x±SD)表示。

2　結果

2.1胚胎發(fā)育

云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交受精卵呈透明的球形(圖版 Ⅰ-1)，油球明顯，卵徑為(0.861±0.012)mm，油球徑為(0.210±0.008)mm，在水溫(22±1)℃、鹽度33的海水中孵化，經過35h23min完成整個胚胎發(fā)育過程，早期胚胎發(fā)育各個階段的形態(tài)如圖版Ⅰ所示。胚胎發(fā)育可分為卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期和器官形成期，胚胎發(fā)育時序如表1所示。

表1　云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交子代受精卵胚胎發(fā)育過程時序

續(xù)表1

注：受精卵孵化溫度(22±1)℃，鹽度33。

Note：Hatchingtemperatureandsalinitywere(22±1)℃and33respectively.

2.1.1卵裂期

云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交受精卵卵裂方式屬于盤狀卵裂，受精后32min可見胚盤隆起(圖版Ⅰ-2)；受精后1h1min開始第一次卵裂，此時受精卵一分為二，產生2個對等的細胞，進入2細胞期(圖版Ⅰ-3)；受精后1h35min，受精卵進行第二次分裂，進入4細胞期(圖版Ⅰ-4)；受精后2h5min開始第三次分裂，進入8細胞期(圖版Ⅰ-5)；受精后2h43min開始第四次分裂，進入16細胞期(圖版Ⅰ-6)；而后隨著細胞的等分裂，細胞數量不斷增加，經32細胞期(圖版Ⅰ-7)、64細胞期，此時分裂的細胞大小不等，排列不規(guī)則(圖版Ⅰ-8)和多細胞期(圖版Ⅰ-9)，受精4h38min后進入桑葚期(圖版Ⅰ-10)，此時的細胞體積變得更小，細胞間界限不明顯，整個細胞團呈圓形。

2.1.2囊胚期

隨著細胞分裂的進行，細胞的層數和數量不斷增加，此時在胚盤與卵黃之間形成囊胚腔，囊胚中部呈高帽狀突起，胚胎開始進入高囊胚期(圖版Ⅰ-11)；受精后6h30min，囊胚隆起開始變低，細胞逐漸下包，胚胎發(fā)育進入低囊胚期(圖版Ⅰ-12)。

2.1.3原腸胚期

隨著細胞分裂的進行，胚胎動物極細胞向植物極遷移和下包，受精后9h33min，胚層下包卵黃的四分之一，此時通過側面觀察可見一個新月形的胚盾，胚胎發(fā)育進入原腸初期(圖版Ⅰ-13)；受精后12h53min，胚層下包卵黃的二分之一，胚環(huán)位于胚胎中間位置，胚胎發(fā)育進入原腸中期(圖版Ⅰ-14)；受精后14h40min，胚層下包卵黃的四分之三，胚胎發(fā)育進入原腸末期(圖版Ⅰ-15)。

2.1.4神經胚期

原腸期結束后，隨著細胞分裂的進行，開始進入神經胚期，受精后15h45min，胚體形成神經板，其中央可見圓柱形脊索，胚體雛形，開始進入胚體形成期(圖版Ⅰ-16)；隨后胚環(huán)逐漸下包收縮成小圓孔(即胚孔)，受精后17h40min，胚層下包整個胚胎，胚孔閉合，此時胚胎發(fā)育進入胚孔封閉期(圖版Ⅰ-17)。

2.1.5器官形成期

受精后18h47min，在胚體頭部的前兩側分化出眼原基，形成視囊，胚體進入視囊形成期(圖版Ⅰ-18)；受精后21h15min，脊索兩側出現肌節(jié)原基，胚體進入肌節(jié)出現期(圖版Ⅰ-19)；受精后22h18min，胚體肌節(jié)變多，在視囊后方兩側出現1對聽囊，胚體進入聽囊形成期(圖版Ⅰ-20)；受精后24h55min，胚體的視囊之間出現腦泡，呈橢圓形板狀，此時的腦泡尚未分室，胚體進入腦泡形成期(圖版Ⅰ-21)；受精后27h10min，胚體逐漸形成鰭褶，尾部逐漸與卵黃囊分離，胚體發(fā)育至尾芽期(圖版Ⅰ-22)；受精后28h45min，此時視囊內可見折光性強的透明狀晶體，胚體抽動明顯，胚體發(fā)育進入晶體形成期(圖版Ⅰ-23)；受精后30h5min，可見胚體心臟開始跳動，胚體進入心臟跳動期(圖版Ⅰ-24)；受精后31h20min，仔魚孵化時胚體的頭部先破膜伸出，尾部仍在膜內劇烈擺動(圖版Ⅰ-25)。受精后32h06min，大部分的仔魚孵出，仔魚浮于水面，無游泳能力(圖版Ⅰ-26)。

2.2雜交受精卵胚胎發(fā)育孵化率及畸形

云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交受精卵呈透明的球形，油球明顯，卵徑為(0.861±0.012)mm，油球徑為(0.210±0.008)mm。云紋石斑魚的卵子和鞍帶石斑魚的精子具有較好的配子相容性，可受精產生正常發(fā)育的雜交子代。雜交組合的孵化率為91.5%，略低于對照組的93.1%，影響雜交受精卵孵化率的是在胚胎發(fā)育的卵裂期和囊胚期(圖版Ⅰ-27)。雜交組合的畸形率為10.5%，也較云紋石斑魚(♀)×云紋石斑魚(♂)的受精卵高(畸形率5.3%)，畸形主要分布在仔魚出膜前后：(1)仔魚在卵膜中就已經是畸形造成不能正常出膜(圖版Ⅰ-28)；(2)仔魚出膜之后出現畸形不能正常發(fā)育(圖版Ⅰ-29)。

2.3仔稚幼魚形態(tài)發(fā)育

2.3.1前期仔魚

仔魚初孵至卵黃囊消失為前期仔魚階段。

初孵仔魚：仔魚浮于水面，無游泳能力，卵黃囊呈橢圓形，鰭褶起自頭部后方，繞過尾部，終止于肛門后部，仔魚脊索細長，身體透明，初孵仔魚全長：(2.215±0.091)mm(圖版Ⅰ-26)。

1日齡仔魚：卵黃囊較前一天明顯收縮(圖版Ⅱ-1)。

2日齡仔魚：卵黃囊即將消失，油球明顯，仔魚口裂形成，但未攝食，仍為內源性營養(yǎng)階段(圖版Ⅱ-2)。

3日齡仔魚：眼部黑色素增加，視覺形成。魚體出現2處黑色素沉積，一處在消化道中央上方位置，另一處在肛門與尾端之間，胸鰭呈葉狀，游泳能力較之前明顯增強，仔魚口裂明顯，消化道中還未見生物餌料(圖版Ⅱ-3)。

2.3.2后期仔魚

卵黃囊消失至第二背鰭棘和腹鰭棘達到仔稚魚階段的最大值。

4日齡仔魚：消化系統(tǒng)的發(fā)育更加完善，腹部的黑色素幾乎包圍整個消化道，仔魚已攝食，消化道中可見生物餌料，腹鰭棘開始出現，胸鰭進一步生長、呈透明的扇形，仔魚開始有集群行為(圖版Ⅱ-4)。

7日齡仔魚：腹鰭棘明顯，背鰭棘原基開始出現，鰓蓋骨明顯，胸鰭更加發(fā)達，活力更強，仔魚游動速度加快，集群在池邊和池角活動(圖版Ⅱ-5)。

10日齡仔魚：魚體肌節(jié)呈“V”型，第二背鰭棘已明顯可見，第二背鰭棘末端開始出現少量的黑色素，腹鰭棘進一步增長，腹鰭棘比第二背鰭棘長，尾部鰭膜開始出現黑色的鰭條絲(圖版Ⅱ-6)。

15日齡仔魚：第一背鰭棘出現，第二背鰭生長迅速，長度開始超過腹鰭棘，長棘仍呈鋸齒狀，尾柄中部的黑色素減少，尾椎開始向上彎曲，尾鰭呈輻射狀扇形，肌節(jié)呈“W”型(圖版Ⅱ-7)。

27日齡仔魚：仔魚各鰭基本形成，尾鰭已由圓形轉變?yōu)榻匦挝?，尾椎骨出現黑色素，第二背鰭棘和腹鰭棘長度達到仔稚魚階段的最大值，第二背鰭棘長度超過體長的一半，此后第二背鰭棘和腹鰭棘開始收縮(圖版Ⅱ-8)。

2.3.3稚魚期

第二背鰭棘和腹鰭棘開始收縮至稚幼魚階段的最小值，鱗片和體色開始出現。

30日齡稚魚：第二背鰭棘和腹鰭棘收縮明顯，鰭棘上面的小刺開始收回，鰭棘末端的黑色素消失，臀鰭明顯，眼睛后緣出現黑色素群(圖版Ⅱ-9)。

38日齡稚魚：尾椎骨上的黑色素明顯，第二背鰭棘和腹鰭棘較之前已明顯收縮，但是第二背鰭棘的長度仍是鰭棘中最長的，鱗片在背鰭基部的兩側以及身體的背面開始出現(圖版Ⅱ-10)。

2.3.4幼魚期

體色與成魚相似，全身覆蓋鱗片。

46日齡幼魚：幼魚各鰭的形態(tài)與成魚相似，幼魚條帶和體色明顯，全身覆蓋鱗片，第二背鰭棘和腹鰭棘收縮到稚幼魚階段最小值之后又開始生長(圖版Ⅱ-11)。

3　討論

3.1雜交子代與其親本胚胎發(fā)育的比較

云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交受精卵的胚胎發(fā)育，與其親本具有共同的特性，同時也存在差異：雜交受精卵的卵徑為(0.861±0.012)mm，大于鞍帶石斑魚受精卵的0.790～0.850mm[15]，與對照組云紋石斑魚的受精卵接近；在相同孵化條件下，雜交受精卵與云紋石斑魚受精卵兩者所經歷的各個時期及各時期的形態(tài)特征無明顯差別，但是仔魚初孵的時間比對照組(云紋石斑魚♀×云紋石斑魚♂)快1h；雜交受精卵的胚胎發(fā)育的大部分時期都晚于其父本鞍帶石斑魚的胚胎發(fā)育，但是初孵仔魚全長(2.215±0.091)mm與云紋石斑魚仔魚全長接近，較鞍帶石斑魚仔魚長(1.660±0.060)mm[2]。3.2雜交子代與其親本仔稚幼魚生長的比較

在石斑魚早期發(fā)育階段的劃分中，大多數學者將背鰭棘、腹鰭棘和軟鰭鰭條的發(fā)育程度作為各個階段劃分的標準。鄒記興等[16]將點帶石斑魚仔魚的腹、背鰭棘開始收縮，鱗片長出前為后期仔魚結束的標志。張海發(fā)等[17]將斜帶石斑魚各鰭基本形成、腹鰭棘和第二背鰭棘開始收縮以及鰭棘上小刺數目急劇減少、鱗片開始長出作為仔、稚魚分界點，將腹鰭棘和第二背鰭棘絕對長度收縮到稚幼魚階段的最小值作為進入幼魚階段的標志。郭仁湘等[18]將鞍帶石斑魚各鰭基本形成作為進入稚魚期的標志。綜合以上學者的劃分標準，可以將本研究27日齡作為結束后期仔魚期進入稚魚期的時間，46日齡進入幼魚階段。通過比較發(fā)現雜交子代具有其父本生長速度快的優(yōu)勢，雜交斑27日齡時第二背鰭棘和腹鰭棘長度達到最大值，各鰭已基本上發(fā)育完成，發(fā)育到稚魚階段的時間要晚于鞍帶石斑魚的22日齡(水溫27～30℃)[18]，但是進入稚、幼魚階段要明顯早于云紋石斑魚的31日齡和66日齡[水溫(23±1)℃][19]。

3.3親本組合的可行性

云紋石斑魚和鞍帶石斑魚為同屬不同種，染色體數目2n=48[20-21]，這具備了雜交的細胞學基礎。本研究屬于種間的遠緣雜交，該雜交組合的母本云紋石斑魚與父本鞍帶石斑魚能產生正常分裂的受精卵，并能夠發(fā)育到幼魚階段。雜交組合的孵化率為91.5%，略低于對照組的93.1%，影響雜交受精卵孵化率的時期主要是在卵裂期和囊胚期，但是雜交受精卵在神經胚期和器官形成期一般都能正常發(fā)育，造成這一現象的原因還有待進一步研究。雜交受精卵的畸形率為10.5%，要高于對照組的5.3%，畸形發(fā)生主要分布在仔魚出膜前后：(1)仔魚在卵膜中就已經是畸形造成不能正常出膜；(2)仔魚出膜之后出現畸形不能正常發(fā)育。楊求華等[14]對云紋石斑魚與赤點石斑魚雜交的研究也表明，雜交受精卵的孵化率較云紋石斑魚與赤點石斑魚低，畸形率也高于對照組。

目前，對云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交育種的研究還未見報道，對雜交子代各方面特性了解還不夠充分，有關雜交子代的低溫耐受性、抗病力等方面是否優(yōu)于親本，還需進一步實驗證實。雜交子代有生長發(fā)育速度較快的雜種優(yōu)勢，也有其不同于親本的發(fā)育特點。本文探討云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交子代胚胎發(fā)育和仔、稚幼魚生長發(fā)育，為雜交石斑魚的魚苗培育和人工養(yǎng)殖提供了科學參考。

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1.受精卵；2.胎盤隆起；3.2細胞期；4.4細胞期；5.8細胞期；6.16細胞期；7.32細胞期；8.64細胞期；9.多細胞期；10.桑葚期；11.高囊胚期；12.低囊胚期；13.原腸初期；14.原腸中期；15.原腸末期；16.胚體形成期；17.胚孔封閉期；18.視囊形成期；19.肌節(jié)出現期；20.聽囊形成期；21.腦泡形成期；22.尾芽期；23.晶體形成期；24.心臟跳動期；25.孵化期；26.初孵仔魚；27.死亡的囊胚期胚胎；28.畸形仔魚；29.未能出膜的仔魚。

1.Fertilizedegg；2.Blastodiscformation；3.2-cellstage；4.4-cellstage；5.8-cellstage；6.16-cellstage；7.32-cellstage；8.64-cellstage；9.Multi-cellstage；10.Morulastage；11.Highblastulastage；12.Lowblastulastage；13.Earlygastrulastage；14.Middlegastrulastage；15.Lategastrulastage；16.Embryobodystage；17.Closureofblastoporestage；18.Opticcapsulestage；19.Muscleburlstage；20.Otocyststage；21.Brainvesiclestage；22.Tail-budstage；23.Crystalstage；24.Heart-beatingstage；25.Hatchingstage；26.Newlyhatchedlarvae；27.Embryostoppedatblastulastage；28.Abnormallarvae；29.Deformedembryo.

1.1d仔魚；2.2d仔魚；3.3d仔魚；4.4d仔魚；5.7d仔魚；6.10d仔魚；7.15d仔魚；8.27d仔魚；9.30d稚魚；10.38d稚魚；11.46d幼魚。

1.Larva1dafterhatching(DAH)；2.2DAH；3.3DAH；4.4DAH；5.7DAH；6.10DAH.7.15DAH；8.27DAH；9.30djuvenile；10.38djuvenile；11.46dyoungfish.

Embryonic and morphological development in larva，juvenile，and young stages of hybrid grouper (Epinephelus moara ♀×E.lanceolatus ♂)

WU Shuiqing1，ZHENG Leyun1*，HUANG Zhongchi1，QIU Denggao1，XU Chaohui1，ZHENG Junpiao2，QIU Fengyan2，WU Jingling1，LIU Yinhua1

(1.KeyLaboratoryofCultivationandHigh-valueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince，FisheriesResearchInstituteofFujian，Xiamen361013，China2.XiamenXiaoDengAquaticScienceandTechnologyCo.，Ltd.，Xiamen361013，China)

Hybridizationisthemostwidelyusedandeffectivemethodofartificialbreedinginaquaculture.Wedocumentedembryonicdevelopmentandthegrowthandmorphologicalcharacteristicsoflarva，juveniles，andyoungfishinthehybrid(Epinephelus moara ♀× E.lanceolatus ♂)byartificialmethods.Theembryonicdevelopmentofthehybridwasdividedintocleavagestage，blastulastage，gastrulastage，neurulastage，andorganogenesisstage.Inseawater[(22±1)℃，salinity33，pH7.8]，35h23minwasrequiredforhybridembryonicdevelopment.Incleavagestage，blastulastage，beforeandafterthelarvae，thehybridhadhighermortality.Statisticsshowedthathybridhatchingratewas91.5%lowerthancontrolgroup(93.1%)，deformityratewas10.5%higherthancontrolgroup(5.3%).Basedonthefeaturesoftheyolksac，seconddorsalfinspine，pelvicfinspine，scalesandbodycolor，thepost-embryonicdevelopmentofthehybridwasdividedintolarval(0～27d)，juvenile(28～45d)，andyoungfishstages(46d).TheresultssuggestedthatthehybridgrowsmorerapidlythanE.moara.

Epinephelus moara；E.lanceolatus；hybrid；embryonicdevelopment；morphologicalobservation

2015-12-30

廈門南方海洋研究中心項目(14PZY017NF17).

吳水清(1987-)，男，實習研究員，碩士，主要從事海水魚類繁育生物學.E-mail：wushuiqing@163.com

鄭樂云(1969-)，男，教授級高級工程師，主要從事海水魚類繁養(yǎng)殖及育種.E-mail：lyzheng69@sina.com

S961.5

A

1006-5601(2016)01-0027-09