金關(guān)榮，程　舟，駱霞虹，楊曉伶，王亦斌，李　珊，朱云國，陳常理*（.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心，浙江杭州 30；.同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 0009）

食用栝樓種苗雌雄性別的DNA鑒定技術(shù)初步研究

金關(guān)榮1，程舟2，駱霞虹1，楊曉伶2，王亦斌2，李珊2，朱云國2，陳常理1*
（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心，浙江杭州 311202；2.同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092）

應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建食用栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜，獲得與食用栝樓雌雄性別相關(guān)的分子標(biāo)記，可準(zhǔn)確、有效地鑒定食用栝樓種苗雌雄性別，為栝樓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

食用栝樓；種苗；雌雄性別；ISSR；鑒定

文獻(xiàn)著錄格式：金關(guān)榮，程舟，駱霞虹，等.食用栝樓種苗雌雄性別的DNA鑒定技術(shù)初步研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1066-1068.

栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）是葫蘆科（Cucurbitaceae）栝樓屬（Trichosanthes L.）多年生草質(zhì)藤本植物，其根、果實、果皮、種子均可入藥，是我國的重要藥用植物資源［1］。食用栝樓，又叫仁栝樓，俗稱吊瓜，是野生栝樓的栽培種，其種子富含脂肪和蛋白質(zhì)、味香爽口、油而不膩，具有較高的食用價值。目前，在長三角地區(qū)尤其是浙江省長興、麗水、江蘇省宜興、常州等縣市栝樓已廣泛種植，僅長興縣今年的種植面積就近6 667 hm2，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。

栝樓是雌雄異株植物，開花前雌、雄株間無明顯的形態(tài)差異，雌雄株難辯。在栝樓栽培生產(chǎn)中雌、雄株的合理搭配在9∶1左右，而用種子繁殖栝樓時其幼苗的雌雄比例約為3∶7，目前產(chǎn)區(qū)多采用開花后人工去除雄株，以控制雌雄株比率。栝樓雌雄株比例失調(diào)直接影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，不僅對土地、資源、人力等方面都造成較大浪費(fèi)，而且已經(jīng)成為制約食用栝樓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。

DNA指紋鑒定技術(shù)是近十幾年發(fā)展起來的研究生物種群遺傳多樣性的有效技術(shù)，可對種、品種甚至個體間的微小差異進(jìn)行有效的標(biāo)記和鑒定，如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增性酶切片段長度多態(tài)性（AFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）等。這些方法由于具有靈敏、所需樣品量少、不受材料外形的影響、直接檢測樣品的遺傳物質(zhì)DNA等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于基因定位、醫(yī)學(xué)鑒定以及種質(zhì)資源的鑒定和保護(hù)等領(lǐng)域。特別是對于檢測生物個體間的細(xì)微差別具有其他方法難以比擬的優(yōu)越性。

ISSR（inter-simple sequence repeat）簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性，是利用生物基因組中常出現(xiàn)的簡單序列重復(fù)SSR（simple sequence repeat）設(shè)計引物，檢測多態(tài)性的一種分子標(biāo)記。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、無須預(yù)先知道DNA序列、比RAPD標(biāo)記更為靈敏、穩(wěn)定且實驗重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［2-4］。

以往對栝樓的研究較少，僅對其生物學(xué)特性、栽培技術(shù)、病蟲害防治、遺傳多樣性、內(nèi)含物等方面有少量報道［3-7］，對栝樓雌雄株DNA鑒定的研究尚屬空白。因此，本研究嘗試應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜，尋找與性別相關(guān)的分子標(biāo)記，優(yōu)化操作程序，建立準(zhǔn)確、有效、實用的食用栝樓種苗雌雄性別鑒定技術(shù)，為栝樓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料

2005年5月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究開發(fā)中心苗圃，從已知雌雄性別的3年生食用栝樓植株中選取6株雄株和10株雌株的新鮮葉片，用于DNA指紋圖譜分析。另選已知雌雄性別的2年生食用栝樓種苗30株用于驗證實驗。

1.2基因組DNA的提取

取上述各栝樓植株的新鮮嫩葉0.2 g，用液氮研磨后轉(zhuǎn)入離心管中，加入600μL預(yù)熱的CTAB緩沖液（2%CTAB、1.4 mol·L-1NaC1、0.2%β-巰基乙醇、100 mmol·L-1Tris-HC1、20 mmol·L-1EDTA，pH值8.0），65℃保溫1 h。加入600μL氯仿/異戊醇混合液（體積比24∶1），輕搖混勻5 min，室溫12 000 r·m in-1離心10 min。取上清，加入500μL氯仿/異戊醇混合液（24∶1），輕搖混勻10 m in，12 000 r·m in-1離心10 m in。取上清，加入1/10體積的3 mol·L-1NaAc和2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后在-20℃中保存30 m in。10 000 r·min-1離心5 m in，取沉淀，用70%乙醇清洗，5 000 r·min-1離心5 min。取沉淀干燥后用100μL TE緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HC1、1 mmol·L-1EDTA，pH值8.0）溶解，用0.7%的瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量。

1.3ISSR引物篩選和PCR擴(kuò)增

選擇雌雄各2株的4個DNA樣品篩選14條ISSR引物，即The University of British Columbia（UBC）SSR Primer（RAPD）Synthesis Project Oligonucletide Set 100/9（表1）。反應(yīng)體系20μL含2 mmol·L-1MgC12、0.25 mmol·L-1dNTPs、0.2μmol·L-1引物、10 ng模板、1×buffer和0.75 U Fx Taq DNA聚合酶（TaKaRa）。使用Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min；40個循環(huán)：94℃變性45 s，48～55℃退火45 s（退火溫度隨引物變化見表1），72℃延伸45 s；最后72℃延伸10 min。

表1　本研究所用的ISSR引物

擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離（以100 V恒壓電泳35 min），以100 bp DNA Ladder Plus（MBI Fermentas）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用1μg· m L-1溴化乙啶染色后于UVP-GDS8000自動成像儀中拍照、觀察、記錄并保存電泳圖片，構(gòu)建栝樓雌雄植株的DNA指紋圖譜。

2　結(jié)果與分析

2.1食用栝樓雌雄株的ISSR指紋圖譜的構(gòu)建

用已知雌雄性別的栝樓DNA樣品從14條ISSR引物中篩選出8個擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物，對所有樣本進(jìn)行擴(kuò)增。其中引物826和861兩條引物對已知雌雄性別的栝樓的DNA擴(kuò)增結(jié)果表明，栝樓雌雄植株在ISSR指紋圖譜上表現(xiàn)出明顯的差異。在ISSR指紋圖譜（引物826）上，栝樓雌株在2 100 bp處出現(xiàn)特征性條帶，栝樓雄株則在1 100 bp處出現(xiàn)特征性條帶（圖1）。在ISSR指紋圖譜（引物861）上，栝樓雌株在1 400和1 000 bp處出現(xiàn)特征性條帶，栝樓雄株則在700 bp處出現(xiàn)特征性條帶（圖2）。根據(jù)栝樓雌雄株在ISSR指紋圖譜上的特征性條帶，可對栝樓種苗的雌雄性別進(jìn)行早期鑒定。

圖1　食用栝樓種苗雌雄植株的ISSR指紋圖譜（引物826）

2.2食用栝樓種苗雌雄性別鑒定

根據(jù)構(gòu)建的栝樓雌雄株的ISSR指紋圖譜及其特征性條帶，對栝樓種苗的雌雄性別鑒定的可靠性進(jìn)行了驗證實驗，對已知雌雄性別的數(shù)十株栝樓種苗進(jìn)行了DNA鑒定。圖3展示的是用ISSR引物826擴(kuò)增出的食用栝樓種苗（雌株）及對照樣品栝樓雄株、雌株、野生株的指紋圖譜，結(jié)果食用栝樓種苗雌雄性別鑒定100%成功。同樣，用ISSR引物861擴(kuò)增出的指紋圖譜也可以成功鑒定食用栝樓種苗的雌雄性別（圖2）。

3　小結(jié)

食用栝樓雌雄植株的ISSR-DNA指紋圖譜差異明顯，并獲得與雌雄性別相關(guān)的特征性條帶。根據(jù)已構(gòu)建的栝樓雌雄植株的ISSR指紋圖譜和特征性條帶，可準(zhǔn)確、有效地將栝樓種苗的雌雄性別鑒定出來。本研究結(jié)果為食用栝樓雌雄株的鑒別、雌雄株合理搭配供應(yīng)及配比栽培提供技術(shù)保障，對栝樓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義及應(yīng)用前景。

圖2　用ISSR引物861擴(kuò)增出的食用栝樓種苗的指紋圖譜

圖3　用ISSR引物826擴(kuò)增出的食用栝樓種苗的指紋圖譜

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版，2005：73-74.

［2］ 廖文芳，夏念和，鄧云飛，等.華木蓮的遺傳多樣性研究［J］.云南植物研究，2004，26（1）：58-64.

［3］ 楊廷楨，高敬東，楊明霞，等.栝樓的經(jīng)濟(jì)價值及栽培技術(shù)要點(diǎn)［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2003（10）：48-49.

［4］ 彭桂福，李彩琴，孫耘子.食用栝樓的生育特性及栽培技術(shù)［J］.中國西瓜甜瓜，2003（4）：44-46.

［5］ 高燕會，李慧慧，朱玉球，等.基于ISSR的栝樓遺傳多樣性分析［J］.中草藥，2011，42（2）：263-266.

［6］ 李慧慧，朱玉球，斯金平，等.栝樓ISSR-PCR體系的正交優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2009，19（6）：38-41.

［7］ 李珊，程舟，李彥，等.雌雄栝樓植株內(nèi)含物比較研究［J］.中草藥，2008，39（2）：260-263.

（責(zé)任編輯：張 韻）

S567

A

0528-9017（2016）07-1066-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160734

2016-02-16

國家星火計劃項目（2005EA700082）

金關(guān)榮（1959—），男，浙江杭州人，副研究員，從事經(jīng)濟(jì)作物育種、栽培及利用研究工作，E-mai1：jingr0@163.com。

陳常理（1975—），男，助理研究員，碩士，從事經(jīng)濟(jì)作物育種、栽培及耕作科研工作，E-mai1：chenchangli66@163.com。