簡偉明，劉小慧，梁慧佳，李潔儀，焦春偉

(廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663)

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破壁靈芝孢子粉甾醇類HPLC指紋圖譜的建立及其抗腫瘤活性“譜效”關(guān)系

簡偉明，劉小慧，梁慧佳，李潔儀，焦春偉

(廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663)

建立了破壁靈芝孢子粉甾醇類高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的分析方法，采集了10批不同產(chǎn)地破壁靈芝孢子粉HPLC圖譜，運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版”軟件建立破壁靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)圖譜。并利用生物細(xì)胞模型技術(shù)得到了10批破壁靈芝孢子粉樣品粗甾醇提取物的抗人惡性乳腺癌細(xì)胞(MT-1)抑制率曲線及半數(shù)有效劑量(IC50)，運(yùn)用多元線性回歸統(tǒng)計方法，將抗腫瘤活性參數(shù)IC50與HPLC指紋圖譜共有峰的標(biāo)準(zhǔn)化峰面積比值關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明：方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性符合方法學(xué)要求；建立的甾醇類HPLC指紋圖譜共得到15個共有峰，各樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均在0.9以上。經(jīng)抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性參數(shù)IC50研究及統(tǒng)計分析表明，指紋圖譜中與抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性關(guān)系密切的峰為1、3、6、8、9、14號，即麥角甾醇等6個成分是其主要活性成分。

破壁靈芝孢子粉；甾醇；高效液相色譜(HPLC)；指紋圖譜；抗腫瘤活性；“譜效”關(guān)系

靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的極其細(xì)小的孢子，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，但由于靈芝孢子壁是一層既不溶于水，也不溶于酸的幾丁質(zhì)，孢子進(jìn)入腸胃后，有效成分無法被人體吸收利用，因此其深加工產(chǎn)品破壁靈芝孢子粉更為廣大消費者所接受。因此，有必要建立有效的檢測方法對破壁靈芝孢子粉產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制。

研究表明，破壁靈芝孢子中富含人體必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物堿和三萜類等物質(zhì)[1]，而其中粗多糖與總?cè)剖悄壳矮@得業(yè)內(nèi)公認(rèn)的功效評價指標(biāo)，一般檢測方法僅是分光光度法[2-3]，在特異性方面稍存局限，并且無法反映出破壁靈芝孢子粉的整體信息。而破壁靈芝孢子粉中甾醇類物質(zhì)鮮有報道。

靈芝中甾醇類物質(zhì)含量豐富，其中麥角甾醇含量可達(dá)0.3%[4]，已知從靈芝中分離提取到的甾醇有麥角甾醇、羊毛甾-7,9(11)，24-三烯-3β，21-二醇、麥角甾醇過氧化物等20多種[5]，然而除麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品較易獲得外，其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均難以獲得。甾醇類化合物的提取分離多以乙醇為提取原料，然后用氯仿萃取，再用NaOH水溶液萃取氯仿溶液，除去酸性部分，得到中性部分，然后用硅膠層析分離甾醇類化合物[6]或?qū)⒅行圆糠衷?0～90 ℃條件下皂化，再經(jīng)萃取，濃縮得到粗甾醇[7]，本文參考上述甾醇提取方法對破壁靈芝孢子粉進(jìn)行樣品制備，并以甾醇類物質(zhì)為研究對象，系統(tǒng)地建立了破壁靈芝孢子粉的HPLC/DAD指紋圖譜，同時將HPLC色譜法和生物細(xì)胞模型技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用多元線性回歸方法，考察破壁靈芝孢子粉粗甾醇提取物HPLC指紋圖譜與抗人惡性乳腺癌細(xì)胞(MT-1)活性的相關(guān)性，通過“譜效”[8-9]關(guān)系篩選出能表征破壁靈芝孢子粉功效性的特征指紋圖譜，以有效地控制破壁靈芝孢子粉質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1材料

靈芝孢子粉樣品來自全國5個省份的不同生產(chǎn)廠家，具體見表1。經(jīng)低溫物理破壁后過80目篩制成破壁靈芝孢子粉。

表1　破壁靈芝孢子粉樣品來源

1.2主要儀器和試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(配備二極管陣列檢測器),由美國安捷倫公司生產(chǎn)；AgilentZOBAXEclipseXDB-C18(250mm×4.6mm,5μm)不銹鋼柱；AUY220型島津分析天平；法國MilliporeMilli-QA10超純水凈化系統(tǒng)。

麥角甾醇對照品購自Sigma公司；甲醇(色譜純)由美國fisher公司生產(chǎn)。RPMIMedium1640basic(1640培養(yǎng)基)、0.25%EDTA胰酶消化液，由美國gibco公司生產(chǎn)；PBS(1*)、青鏈霉素溶液(100*)由吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)；培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板由德國Greiner公司生產(chǎn)；HighPurePCRTemplatePreparationKit由Roche公司生產(chǎn)；Caspase-3/CPP32ActivityColorimetricAssayKit由美國BioVision公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的制備精密稱取麥角甾醇10mg于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，備用。

取樣品100g，加入20倍體積的95%乙醇90 ℃回流提取2h，重復(fù)2次。提取液濃縮成浸膏，將浸膏懸浮于熱水中，用氯仿萃取3次。氯仿層加入2%NaOH溶液萃取，重復(fù)若干次。收集氯仿層的中性部分。中性部分加入1mol/LKOH乙醇液80 ℃下皂化1h，冷卻后以正己烷萃取，得總甾醇部分，備用。

1.3.2HPLC指紋圖譜的建立

1.3.2.1色譜條件色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流速1.0mL/min；檢測波長210nm，進(jìn)樣體積20μL；柱溫30 ℃。流動相A：甲醇，流動相B：超純水。梯度洗脫程序：0min(40%A)→15min(90%A)→25min(100%A)→45min(100%A)。

1.3.2.2方法學(xué)考察穩(wěn)定性試驗：取1號樣品溶液于0、4、8、12、24h測定，考察方法的穩(wěn)定性。

精密度試驗：取1號樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，考察方法的精密度。

重現(xiàn)性試驗：取1號樣品，按1.3.1的方法平行制備供試液5份，記錄5份樣品的色譜圖，考察方法的重現(xiàn)性。

1.3.2.3HPLC指紋圖譜的構(gòu)建按照1.3.1的方法制備10批不同來源的破壁靈芝孢子粉供試液，記錄HPLC色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件，將10批破壁靈芝孢子粉樣品色譜圖以AIA格式導(dǎo)入，以1號為參照圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.1min，進(jìn)行峰譜自動匹配。以平均數(shù)法作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜的生成方法。

1.3.2.4指紋圖譜的評價以指紋圖譜中峰面積最大的峰為參照峰，以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算10批樣品共有指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件計算指紋圖譜的相似度。

1.3.2.5特征波長選擇及特征峰定性按1.3.2.1色譜條件，分別嘗試210、283、360nm的檢測波長，取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液上HPLC分析。通過保留時間的比對，確定樣品色譜圖中麥角甾醇特征峰。

1.3.3“譜效”關(guān)系的研究

1.3.3.1抗腫瘤活性參數(shù)IC50的測定取對數(shù)生長期人惡性乳腺癌細(xì)胞(MT-1)，計數(shù)后細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，細(xì)胞數(shù)為1×104個/孔。將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后，取經(jīng)1.3.1方法制備的各樣品粗甾醇提取物分別以濃度80、100、120、140、160μg/mL給藥，5個平行。培養(yǎng)24h后，鏡檢發(fā)現(xiàn)，濃度間有明顯差異，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD492nm處測量各孔的吸光值。繪制濃度-抑制率曲線得到IC50。

1.3.3.2“譜效”關(guān)系分析測定各樣品色譜峰峰面積，與同類峰面積最大值相除，得到標(biāo)準(zhǔn)化峰面積比值，作為自變量，以抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性IC50作為因變量，利用SPSS16.0軟件進(jìn)行多元線性回歸分析。

2　結(jié)果與分析

2.1破壁靈芝孢子粉指紋圖譜建立

按1.3.1和1.3.2.1方法制備及測定樣品，對10批不同來源的破壁靈芝孢子粉粗甾醇提取物進(jìn)行測定，記錄45min色譜圖，通過比較各色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件，對其進(jìn)行自動校正，生成匹配譜圖(圖1)。

圖1　破壁靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

2.2方法學(xué)考察

在0、4、8、12、24h測定1號供試品溶液的色譜圖，各主要色譜峰相對保留時間RSD小于1.0%，相對峰面積的RSD為1.2%～2.0%。1號供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，色譜圖的各主要色譜峰相對保留時間RSD為0.3%～0.8%，相對峰面積的RSD為0.8%～1.5%，平行制備1號樣品5份，其色譜圖相對保留時間RSD為0.4%～0.8%，相對峰面積的RSD為1.6%～3.0%。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性良好。

2.3破壁靈芝孢子粉指紋圖譜評價

以指紋圖譜中峰面積較大的8號峰為參照物峰，以參照物峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算10批樣品共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，10批樣品共有指紋峰的相對保留時間RSD小于1.0%，而相對峰面積RSD較大。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件進(jìn)行破壁靈芝孢子粉HPLC/DAD指紋圖譜相似度計算，結(jié)果見表2。10批破壁靈芝孢子粉樣品與對照圖譜的相似度均在0.9以上，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》[10]的要求，說明建立指紋圖譜研究對象可信。

表2　10批破壁靈芝孢子粉樣品相似度計算結(jié)果

2.4特征波長的選擇與特征峰定性

根據(jù)指紋峰最多的選定原則[11]，經(jīng)波長210、283、360nm測定后發(fā)現(xiàn)，在波長210nm下得到的響應(yīng)最多(圖2)。同時，麥角甾醇在210nm和283nm均有響應(yīng)，經(jīng)保留時間比對，確定出峰時間為29.749min的色譜峰(14號峰)為麥角甾醇峰。因此，選定210nm為指紋圖譜測定波長。

圖2　不同檢測波長下破壁靈芝孢子粉指紋圖譜

2.5各樣品抗腫瘤活性參數(shù)IC50分析

按1.3.3.1方法，以人惡性乳腺癌細(xì)胞(MT-1)為功效評價對象，測定各破壁靈芝孢子粉樣品粗甾醇提取物的抗腫瘤活性，結(jié)果見表3。IC50分別為：81.35、80.93、131.49、115.20、101.19、120.17、115.31、128.89、121.44、>160μg/mL。

表3　各樣品不同給藥濃度下抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性抑制率 %

2.6“譜效”關(guān)系分析

測定10批不同產(chǎn)地破壁靈芝孢子粉指紋圖譜中的色譜峰A1～A15的峰面積，與同類峰面積最大值相處，得到標(biāo)準(zhǔn)化峰面積比值，作為自變量，以抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性IC50作為因變量，利用SPSS16.0軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果有1號、3號、4號、6號、8號、9號、11號、13號、14號等9個色譜峰被引入回歸方程，得到回歸方程為：

Y=0.976X1+0.740X3-0.285X4+1.011X6+1.219X8+0.782X9-1.510X11-0.014X13+1.407X14

此方程顯示，X1、X3、X6、X8、X9、X14所代表的1號、3號、6號、8號、9號、14號色譜峰與抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性呈正相關(guān)，抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性能力隨指紋圖譜的1號、3號、6號、8號、9號、14號色譜峰強(qiáng)度增大而增大，其中14號峰為麥角甾醇，已被證實具有抗腫瘤作用[12-13]。其余色譜峰具體成分與結(jié)構(gòu)尚待進(jìn)一步研究證實。因此，本文確定1號、3號、6號、8號、9號、14號為特征性色譜峰。

3　小結(jié)與討論

本文按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》[8]的要求，建立破壁靈芝孢子粉甾醇類HPLC指紋圖譜的分析方法，得到15個共有峰，穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性良好，符合方法學(xué)要求；并對10批樣品的相似度進(jìn)行了考察，生成破壁靈芝孢子粉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.9以上。研究了各樣品中15個共有峰的峰面積含量，并得到了粗甾醇提取物對人惡性乳腺癌細(xì)胞濃度-抑制率曲線及其參數(shù)IC50，兩者經(jīng)多元線性回歸，進(jìn)行“譜效”關(guān)系研究，明確了破壁靈芝孢子粉指紋圖譜共有峰與抗人惡性乳腺癌細(xì)胞活性的相關(guān)性，證實了破壁靈芝孢子粉中麥角甾醇等6個色譜峰所代表化合物的含量高低可能影響其活性，將常規(guī)化學(xué)檢定與生物檢定相結(jié)合進(jìn)行“譜效”關(guān)系研究，為破壁靈芝孢子粉的生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供了有效方法。

[1] 陳寶田，龍亞秋，李華.靈芝孢子粉的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥房，2010，21(15)：1439-1440.

[2] 許玲，李曄，黃晉之，等.蒽酮-硫酸法測定靈芝破壁孢子粉中多糖含量的研究[J].海峽藥學(xué)，2009,21(7)：69-71.

[3] 韓丁，林燕飛，孫靜蕓，等.靈芝破壁孢子粉中總?cè)扑岷繙y定[J].浙江中醫(yī)雜志，2012,47(11)：846-847.

[4] 林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究(第二版)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001.

[5] 陸慧，賈曉斌，陳彥，等.靈芝甾醇類活性成分及其抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011,26(2)：325-329.

[6] 申明月.黑靈芝甾醇類的結(jié)構(gòu)表征及其提取物活性和指紋圖譜研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2007.

[7] 萬建春，張維農(nóng).天然植物甾醇的分離純化[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2006,25(4)：12-17.

[8] 李友，馬莉，沈芃，等.板藍(lán)根三氯甲烷提取部位抗內(nèi)毒素作用的“譜效”關(guān)系研究[J].中國藥學(xué)雜志，2011,46(10):741-744.

[9] 趙玉瓏.不同來源三七的“譜-效”關(guān)系及其抗凝血有效成分的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[10] 國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)(國藥管注[2000]348號)[S].

[11] 羅國安，梁瓊麟，王義明.中藥指紋圖譜-質(zhì)量評價、質(zhì)量控制與新藥開發(fā)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[12] 高虹，史德芳，楊德,等.巴西菇麥角甾醇抗腫瘤活性及作用機(jī)理[J].中國食用菌，2011,30(6):35-39.

[13] 肖琳，劉明，吳寧,等.麥角甾醇氧化產(chǎn)物靶向survivin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[C]//2013年醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十三屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議，2013.

(責(zé)任編輯:曾小軍)

ConstructionofHPLCFingerprintsofSterolsinBrokenGanoderma lucidumSporesandRelationshipsbetweenTheirFingerprintandAntitumorActivity

JIANWei-ming,LIUXiao-hui,LIANGHui-jia,LIJie-yi,JIAOChun-wei

(GuangdongYueweiEdibleFungiTechnologyCompanyLimited,Guangzhou510663,China)

AmethodfortheanalysisofHPLCfingerprintsofsterolsinbrokenGanoderma lucidumsporeswasconstructed.TheHPLCfingerprintsof10batchesofbrokenGanoderma lucidumsporesamplesfromdifferentproducingareaswerecollected,andastandardfingerprintofbrokenGanoderma lucidumsporeswasconstructedbyusingthesoftware“SimilarityevaluationsystemoftraditionalChinesemedicinechromatographicfingerprints(2004edition)”.Theinhibitionratecurveandhalfeffectivedose(IC50)ofcoarsesterolextractfrom10batchesofsamplesagainsthumanmalignantbreastcancercells(MT-1)wereacquiredbyusingbiologicalcellmodeltechnique.TherelationshipbetweentheantitumoractivityparameterIC50andthestandardizedpeakarearatioofcommonpeaksfromHPLCfingerprintswasanalyzedbyusingmultiplelinearregressionstatistics.Theresultsindicatedthat:thestability,accuracyandreproducibilityofthismethodconformedtothedemandsofmethodology;fifteencommonpeakswereobtainedfromtheconstructedHPLCfingerprintsofsterols;thesimilaritiesbetweenthefingerprintsofvarioussamplesandthestandardfingerprintwereallabove0.9.ThestatisticalanalysisofIC50revealedthatthepeakNo. 1,No. 3,No. 6,No. 8,No. 9andNo. 14infingerprintshadclosecorrelationswiththeantitumoractivity,namelyergosterolandother5constituentswerethemainactivecomponentsofsterolsinbrokenGanoderma lucidumspores.

BrokenGanoderma lucidumspores;Sterols;Highperformanceliquidchromatography(HPLC);Fingerprint;Antitumoractivity;Fingerprint-effectrelationship

2016-01-22

廣東省科技計劃項目(2012B020316008)。

簡偉明(1985─)，女，助理工程師，研究方向：食藥用菌的質(zhì)量控制。

S567.31

A

1001-8581(2016)08-0061-05