任倩倩，汪麗佩，趙　煒，陸　紅，謝強敏，張水娟（.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州　005；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州　005；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州0006；.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室，浙江杭州　0058）

甘草查爾酮A抑制ERK1/2/NF-κB途徑減輕吸煙誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

任倩倩1，汪麗佩2，趙煒3，陸紅1，謝強敏4，張水娟1
（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053；
3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室，浙江杭州310058）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.022.html

目的探討甘草查爾酮A（LA）對吸煙誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護作用及相關(guān)機制。方法整體實驗：香煙煙霧暴露構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型，取肺泡灌洗液（BALF）進行白細胞計數(shù)，測定肺內(nèi)角質(zhì)形成細胞衍生趨化因子（KC）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的mRNA和蛋白表達水平，用試劑盒測定肺組織中過氧化物髓化酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）活力以及谷胱甘肽（GSH）水平。肺組織病理切片進行HE染色。離體實驗：香煙煙霧提取物（CSE）誘導(dǎo)上皮細胞損傷，測定細胞內(nèi)白介素-8（IL-8）、MMP-9 mRNA的表達。Western blot分析細胞外信號調(diào)節(jié)激酶l/2（ERK1/2）、p38分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化水平和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的活性。結(jié)果整體實驗顯示LA組肺內(nèi)炎癥細胞數(shù)量及浸潤程度均明顯低于模型組。模型組肺內(nèi)KC、TNF-α、IL-1β、MMP-9 mRNA和蛋白表達較正常對照組均明顯升高，經(jīng)LA處理后，上述指標相比模型組明顯降低。與正常對照組相比，模型組肺內(nèi)MPO活性明顯上升，而SOD活性和GSH水平明顯下降。LA能逆轉(zhuǎn)這種變化，明顯降低MPO活性，升高SOD活性和GSH水平。離體實驗顯示，LA（2.5、5 μmol·L-1）能明顯降低CSE刺激的細胞內(nèi)IL-8和MMP-9 mRNA的高表達。CSE可以誘導(dǎo)細胞ERK1/2磷酸化和胞核內(nèi)NF-κB p65的表達，經(jīng)LA預(yù)處理后，上述指標可明顯抑制。結(jié)論LA可能通過阻斷ERK1/ 2/NF-κB途徑來抑制炎癥介質(zhì)的高表達、調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、下調(diào)金屬蛋白酶，從而發(fā)揮對急性肺損傷小鼠的保護作用。

甘草；甘草查爾酮A；肺損傷；吸煙；肺上皮細胞；細胞因子；信號通路

慢性阻塞性肺部疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種以氣流受限為特征的疾病，它與肺部對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)［1］。COPD目前已成為影響人類生活質(zhì)量的全球性健康問題，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，迄今尚無藥物能遏制COPD病情的進行性發(fā)展，因此迫切需要發(fā)展新的COPD治療方法。從中藥和植物藥中尋找新的有效成分，或從已有的有效成分中發(fā)現(xiàn)新的藥理作用是一個重要方向。盡管COPD發(fā)病機制尚未完全闡明，但目前普遍認為，吸煙是COPD發(fā)生的最主要因素之一［2］，吸煙能誘導(dǎo)炎癥并直接導(dǎo)致肺組織的損傷［3］。COPD的病理生理除小氣道的炎癥外，氧化與抗氧化失衡也是一個很重要的因素［4］。因此，從中藥中尋找抗炎和抗氧化的治療COPD的新藥是一個值得探索的途徑。甘草是中藥中傳統(tǒng)的鎮(zhèn)咳祛痰藥，入藥歷史悠久，性味甘平，歸脾、胃、心、肺經(jīng)，具有益氣補中、潤肺止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿和氨基酸等活性成分［5］。甘草中提取的黃酮單體甘草查爾酮 A （LA）經(jīng)研究表明具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用，能通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，誘導(dǎo)人胃癌細胞的凋亡［6-8］。目前LA對肺損傷的研究也有報道，研究發(fā)現(xiàn)其能抑制細菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）氣道滴入引起的小鼠急性肺損傷，降低肺內(nèi)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）表達。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，LA主要是通過NF-κB和p38/ERK MAPK信號途徑起作用［9-10］，但LA與香煙煙霧所引起的疾病之間的關(guān)系研究，無論是整體上還是離體上均未見到相關(guān)的報道。為此，本研究采用香煙煙霧誘導(dǎo)建立小鼠急性肺損傷模型，同時用香煙煙霧提取物（CSE）誘導(dǎo)肺上皮細胞損傷，觀察LA對肺損傷病理改變、炎癥因子、氧化/抗氧化水平、MAPK信號途徑和胞核內(nèi)NF-κB p65表達的影響，探索LA對香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護作用及其相關(guān)機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與藥品C57BL/6清潔級小鼠，♀，體質(zhì)量（20±2）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物質(zhì)量合格證：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于浙江大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房。人肺上皮細胞BEAS-2B細胞株，購自美國菌種保藏中心（ATCC）細胞庫。LA委托沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院趙余慶教授課題組提取和純化，純度＞98%。3R4F標準香煙購自美國肯塔基大學(xué)煙草研究所（批號200712）。RT-PCR相關(guān)試劑購自日本TaKaRa公司。ELISA試劑盒購于eBioscience公司。過氧化物髓化酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司。ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p38、JNK、p-JNK、NF-κB p65抗體購于Cell Signaling公司。

1.2模型制備與分組給藥整體實驗中，將60只♀C57BL/6清潔級小鼠隨機分為正常對照組、模型組、LA低、中、高劑量組（10、20、40 mg·kg-1）、地塞米松對照組（Dex，1 mg·kg-1）。依據(jù)我們以前報道的方法，建立香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型［11］。香煙煙霧連續(xù)暴露4 d，正常對照組使用空氣進行暴露。各組小鼠預(yù)給藥2 d，每天給藥1次，而后在連續(xù)4 d的煙霧暴露前1 h灌胃給予藥物。末次香煙煙霧暴露結(jié)束后18h處理動物。

在離體實驗中，依據(jù)我們以前報道的方法制作CSE，用CSE刺激人肺上皮細胞（BEAS-2B），誘導(dǎo)上皮細胞損傷［12］。采用不同濃度的 LA（1、2.5、5 μmol·L-1）預(yù)處理1 h，而后加入2.5%CSE誘導(dǎo)上皮細胞損傷，48 h后提取細胞RNA進行細胞因子測定；2.5%CSE誘導(dǎo)30min后提取細胞蛋白進行信號通路研究。

1.3小鼠肺泡灌洗液（BALF）制備和炎癥細胞計數(shù)末次香煙煙霧暴露結(jié)束后18 h，腹腔注射6 g· kg-1烏拉坦處死各組小鼠。分離小鼠氣道，插管，結(jié)扎左肺，進行肺泡灌洗，取50 μL肺泡灌洗液，加同體積白細胞計數(shù)液，100倍光鏡下進行白細胞計數(shù)；其余肺泡灌洗液4℃ 2 000 r·min-1離心10min，沉淀做細胞涂片，室溫干燥后瑞氏-吉姆薩染色，400倍光鏡下依據(jù)形態(tài)學(xué)標準進行細胞分類計數(shù)。

1.4肺組織病理學(xué)觀察按照我們以前報道的方法［11-12］，將肺組織福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，200倍鏡下檢查肺組織炎癥細胞浸潤程度。

1.5ELISA取小鼠肺泡灌洗液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，分別檢測灌洗液中角質(zhì)形成細胞衍生趨化因子（KC）、TNF-α、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶9 （MMP-9）蛋白含量。

1.6MPO、SOD和GSH水平測定取肺組織，制成5%肺勻漿，按試劑盒說明書分別測定上清液中MPO、SOD活力以及GSH的水平。

1.7熒光實時定量PCR測定KC、TNF-α、IL-1β、MMP-9和白介素-8（IL-8）mRNA表達水平用TRIzol試劑提取小鼠肺組織及細胞樣本中總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，詳見Tab 1。用cDNA模板對相關(guān)基因分別進行PCR擴增，擴增條件：95℃ 預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，退火58℃10 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，采用ΔΔCt值法測定基因表達水平。

Tab 1　Primer sequences used in the present study

1.8Western blot將處于對數(shù)生長期的BEAS-2B細胞接種至6孔板中，相應(yīng)處理后，棄培養(yǎng)液，提取細胞蛋白。制備SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，取出硝酸纖維素膜，放入兔抗ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38、p38、JNK、p-JNK、NF-κB p65一抗液中，4℃過夜。次日洗膜后加入熒光二抗，室溫避光搖動2 h，用Odyssey熒光掃描儀，拍攝條帶，采用Quantity one軟件計算灰度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS（20.0版）統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較多組均數(shù)以及SNK檢驗進行兩兩之間的比較。

2　結(jié)果

2.1LA對肺部炎癥細胞的影響對吸煙小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞進行總數(shù)和分類計數(shù)，如Fig 1所示，與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)均有明顯增加（P＜0.01）。LA能明顯抑制吸煙誘導(dǎo)小鼠BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞的增加，呈明顯的量效關(guān)系。LA 40 mg·kg-1組對淋巴細胞和巨噬細胞的增加亦有明顯抑制作用。小鼠肺組織HE染色后發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露的小鼠肺組織中性粒細胞和巨噬細胞浸潤增加，而LA能明顯抑制吸煙小鼠中性粒細胞和巨噬細胞在肺部的浸潤，見Fig 2。

2.2LA對肺內(nèi)細胞因子的影響為了探討LA是否通過抑制炎癥反應(yīng)而保護小鼠急性肺損傷，應(yīng)用熒光實時定量PCR檢測各組小鼠肺組織細胞因子mRNA表達及ELISA法檢測BALF中蛋白水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠肺組織中KC、TNF-α、IL-1β和 MMP-9 mRNA的表達（Fig 3）及BALF中蛋白含量（Fig 4）均明顯升高。與模型組相比，LA 20、40 mg·kg-1組上述指標均明顯降低。

2.3LA的抗氧化效應(yīng)為了探討LA是否通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護吸煙誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠，用試劑盒測定各組小鼠肺組織中MPO、SOD和GSH的水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠肺組織中MPO水平明顯上升（P＜0.01），SOD和GSH水平明顯下降（P＜0.05～0.01）。LA能逆轉(zhuǎn)這種變化，明顯降低MPO水平，升高SOD和GSH水平，見Fig 5。 Fig 1LA inhibits inflammatory cell accumulation in BALF of cigarette smoke-exposed mice（±s，n=10）

A：Total leukocyte cell counts；B：Differential cell counts.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.Licochalcone A（LA）；Dexamethasone（Dex）

Fig 2　LA inhibits inflammatory cells’infiltration in lungs of cigarette smoke-exposed mice（HE，×200）

Fig 3　LA inhibits expression of cytokines mRNA in lung tissues of cigarette smoke-exposed mice（±s，n=10）

2.4LA抑制CSE刺激BEAS-2B細胞表達IL-8 和MMP-9 mRNA利用熒光實時定量PCR檢測各組細胞中IL-8和MMP-9 mRNA的表達。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，2.5%CSE刺激細胞48 h后，IL-8和MMP-9 mRNA的表達明顯上升（P＜0.01），而2.5、5 μmol·L-1的LA能明顯抑制兩者的上升（P＜0.05～0.01）。不加CSE刺激，只單獨給予5 μmol·L-1LA的細胞，IL-8和MMP-9 mRNA的表達與空白對照組細胞（不加CSE，不加藥物）相當，無明顯變化，見Fig 6。

2.5LA對CSE刺激BEAS-2B細胞信號通路活化的影響通過Western blot方法檢測BEAS-2B細胞p38、JNK和ERK1/2磷酸化表達，探索LA治療小鼠急性肺損傷的作用機制。如Fig 7所示，CSE可以誘導(dǎo)p38、JNK和ERK1/2的磷酸化，而LA能劑量依賴性抑制由CSE誘導(dǎo)的肺上皮細胞ERK1/2磷酸化（Fig 7C），但對p38（Fig 7A）和JNK（Fig 7B）磷酸化無明顯抑制作用。采用核質(zhì)分離的方法檢測細胞核內(nèi)NF-κB亞基p65的表達，以進一步探索LA治療小鼠急性肺損傷的作用機制。如Fig 7D所示，2.5%CSE能明顯誘導(dǎo)p65的表達，LA可明顯抑制其表達。

3　討論

COPD以遍及氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征。吸煙是誘發(fā)COPD的主要因素之一，香煙煙霧中含有數(shù)以萬計的有毒有害物質(zhì)，這些有毒化合物一旦進入肺部，就難以代謝排出，從而誘導(dǎo)炎癥并直接導(dǎo)致肺組織的損傷［13］。本研究重點觀察LA對吸煙誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用及作用機制。

Fig 4　LA inhibits expression of cytokines protein in BALF of cigarette smoke-exposed mice（±s，n=10）

COPD的氣道炎癥不同于哮喘，其炎癥細胞主要為中性粒細胞、CD8+T淋巴細胞和巨噬細胞，肺損傷后炎癥細胞的浸潤、活化導(dǎo)致促炎細胞因子的異常表達，與COPD的病理生理過程密切相關(guān)。KC是人IL-8的同源物，通過其受體CXCR2產(chǎn)生作用，是肺中性粒細胞趨化的重要介質(zhì)。有研究顯示，通過小分子抑制劑抑制CXCR2受體，能明顯抑制吸煙誘導(dǎo)動物模型中肺中性粒細胞炎癥［14］。前炎細胞因子，如TNF-α和IL-1β，能增強炎癥反應(yīng)。吸煙可介導(dǎo)COPD患者全身性炎癥反應(yīng)，與非吸煙者相比，吸煙的COPD患者血清中TNF-α表達明顯升高［15］。最近，IL-1β因其參與炎癥反應(yīng)的長期持續(xù)過程而廣受關(guān)注［16］。IL-1β能明顯激活COPD患者體內(nèi)的巨噬細胞，釋放炎癥細胞因子、趨化因子和MMP-9［17］。本研究中，香煙暴露4 d后，小鼠肺部炎癥細胞（中性粒細胞和巨噬細胞）大量聚集，肺泡灌洗液和肺組織中炎癥因子KC、TNF-α及IL-1β的蛋白和mRNA水平明顯上升。LA能有效抑制這些炎癥細胞的聚集和炎癥因子的釋放，提示其對肺損傷的保護作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

體內(nèi)氧化/抗氧化平衡失調(diào)是COPD慢性損傷的重要原因。人們發(fā)現(xiàn)，無論在急性發(fā)作期還是在緩解期均存在兩者作用失調(diào)。煙草中含有大量的氧化劑，刺激炎癥細胞生成內(nèi)源性氧化物，減少抗氧化物生成，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD和GSH是氣道內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，研究表明香煙煙霧可以降低內(nèi)源性抗氧化物的活性。如在人支氣管肺泡上皮細胞實驗中，發(fā)現(xiàn)香煙提取物能降低GSH的含量［18］，而另一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者血漿中 SOD的活性下降［19］。研究顯示，LA能抑制由叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低氧基自由基離子（ROS）水平，減少GSH的消耗［20］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，LA不僅能夠抑制炎癥因子的釋放，而且能夠有效降低MPO活性，同時升高SOD活性和GSH水平。我們的結(jié)果表明，在香煙誘導(dǎo)的小鼠模型中，LA對肺損傷的保護作用可能與調(diào)節(jié)氧化和抗氧化的平衡有關(guān)。

正常人體的氣道、肺泡內(nèi)蛋白酶和抗蛋白酶處于平衡狀態(tài)，這種平衡的失調(diào)，會導(dǎo)致肺實質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞和纖維化。目前認為肺泡損傷和小氣道纖維化是COPD氣流受限的重要原因［21］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶家族，能降解細胞外基質(zhì)蛋白。MMP-9是該家族最重要的成員之一，在纖維化修復(fù)過程中，它是參與細胞外基質(zhì)成分降解的關(guān)鍵酶［22］。研究顯示，在香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥模型中，MMP-9表達明顯上升［23］，另有研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的MMP-9表達較正常人高［24］。本實驗結(jié)果顯示，香煙暴露后，小鼠肺泡灌洗液內(nèi)MMP-9蛋白表達增加，而LA能夠明顯抑制這種蛋白的表達。MMP-9 mRNA的表達變化和其蛋白一致，在整體和離體實驗中，LA均能明顯抑制MMP-9 mRNA的高表達。我們推測LA對香煙誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護作用可能與下調(diào)蛋白酶有關(guān)。

Fig 5　LA inhibits oxidative stress in lung tissues of cigarette smoke-exposed mice（±s，n=10）

?Fig 6　LA suppresses CSE-induced mRNA expression of cytokines in BEAS-2B cells（±s，n=6）

肺上皮屏障是肺抵抗外界環(huán)境的第一道防御系統(tǒng)，在這個屏障里，肺上皮細胞起很重要的防御作用。為進一步探索LA對急性肺損傷的保護作用和作用機制，我們用人肺上皮細胞株BEAS-2B進行了相關(guān)研究。目前的研究［25］和我們的實驗均顯示，在香煙煙霧刺激的人肺上皮細胞中，IL-8表達量的升高幅度比其他炎癥因子高。炎癥細胞的遷移和激活受到細胞因子和趨化因子的調(diào)節(jié)，IL-8又稱CXCL8，是中性粒細胞趨化因子，在COPD發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［26］。Schneider等［27］的研究顯示，COPD患者氣道上皮細胞中 IL-8表達明顯升高。IL-8通過其受體CXCR2發(fā)揮作用，用CXCR2拮抗劑可明顯減輕中性粒細胞炎癥和肺泡損傷。本研究中，2.5%CSE刺激細胞48 h后，IL-8 mRNA的表達明顯上升，而LA能明顯抑制其高表達，進一步證明了LA對肺損傷中炎癥反應(yīng)的抑制作用。

Fig 7　Effects of LA on CSE-induced protein expression of MAP kinases and NF-κB in BEAS-2B cells（±s，n=6）

MAPK家族包括ERK（extracellular signal-regulated kinase）、p38和JNK（c-Jun NH2-terminal kinase），這些通路調(diào)節(jié)細胞的多種生理病理過程，如細胞增殖、分化、遷移、存活和死亡等。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是內(nèi)皮激活過程中重要的調(diào)節(jié)因子，與許多炎癥因子的表達相關(guān)，包括細胞因子和黏附分子NO、TNF-α、MCP-1和CAMs［28-29］。在細胞核內(nèi)，NF-κB以p65/ p50二聚體形式存在，NF-κB的激活過程首先是與IκBα解離，然后p65亞基入核，介導(dǎo)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性［30］。研究報道，CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與MAPK信號通路的激活密切相關(guān)，阻斷MAPK通路的激活能保護上皮細胞，減輕炎癥反應(yīng)、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)［31-32］。Chu等［9］的研究證明LA能通過p38/ERK MAPK信號通路緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的炎癥反應(yīng)，F(xiàn)urusawa等［10］還發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。我們猜測LA調(diào)節(jié)CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與MAPK途徑中的多條信號通路及NF-κB的核轉(zhuǎn)錄有關(guān)。為了驗證這一推測，我們采用Western blot方法檢測BEAS-2B細胞中p38、JNK和ERK1/2的磷酸化表達以及NF-κB的活性。實驗結(jié)果表明，LA能明顯抑制CSE誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化，但對p38和JNK的磷酸化無明顯作用，同時LA也能有效阻斷細胞核內(nèi)NF-κB p65亞基的激活，提示LA發(fā)揮的抗炎作用可能是通過阻斷NF-κB p65的激活以及抑制CSE誘導(dǎo)的ERK1/2 MAPK的激活。

綜上所述，LA對香煙煙霧誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護作用，這種保護作用可能與抑制炎癥介質(zhì)的高表達、調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、下調(diào)金屬蛋白酶有關(guān)，其調(diào)控機制可能與阻斷ERK1/2/NF-κB途徑有關(guān)。

（致謝：本實驗在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸藥物研究實驗室完成。感謝謝強敏教授和實驗室同學(xué)在本課題研究中給予的指導(dǎo)和幫助。感謝沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院趙余慶教授課題組提取和純化甘草查爾酮A。）

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Licochalcone A protects against cigarette smoke-mediated acute lung injury in mice by suppressing ERK1/2/NF-κB pathways

REN Qian-qian1，WANG Li-pei2，ZHAO Wei3，LU Hong1，XIE Qiang-min4，ZHANG Shui-juan1
（1.College of Pharmaceutical Science，2.College of Basic Medical Science，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou310053，China；
3.the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou310006，China；4.Zhejiang Respiratory Drugs Research Laboratory，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou310058，China）

AimTo explore the protective roles of licochalcone A（LA）on mice with cigarette smoke-mediated acute lung injury and the related mechanisms. MethodsIn vivo：Mice were exposed to cigarette smoke（CS）to establish acute lung injury model.The bronchoalveolar lavage fluid（BALF）was conducted for cell counting.The mRNA and protein expression of keratinocyte-derived chemokine（KC），tumor necrosis factor alpha（TNF-α），interleukin 1β（IL-1β）and matrix metalloproteinases（MMP）-9 in lungs were determined.The myeloperoxidase（MPO），superoxide dismutase（SOD）activities and glutathione（GSH）levels in lungs were quantified.The paraffin sections of lungs were prepared and stained with HE.In vitro：Human lung epithelial cells（BEAS-2B）were exposed to cigarette smoke extract（CSE），which induced cell injury.The releases of interleukin 8（IL-8）and MMP-9 were assessed.The phosphorylation of mitogen-activated protein kinases（MAPKs，including ERK1/2，p38 and JNK）and nuclear factor-κB（NF-κB）p65 protein were analyzed by Western blot.ResultsIn vivo：The accumulation of inflammatory cells was lower in LA groups than that in model group.In comparison with normal control group，the mRNA and protein lev-els of KC，TNF-α，IL-1β and MMP-9 were significantly increased in model group.Following treatment with LA，the above indicators were significantly decreased as compared to model group.In the CS-exposed mice，the MPO activity in lungs was significantly increased，meanwhile the SOD activity and GSH level were significantly decreased compared with the air-exposed animals.CS-induced activity of MPO was significantly inhibited，which were accompanied by increases in SOD and GSH levels by LA.In vitro：CSE-induced mRNA levels of IL-8 and MMP-9 were significantly inhibited by LA at 2.5 and 5 μmol·L-1.The CSE-induced phosphorylation of ERK1/2 and nucleus NF-κB p65 protein expression were prevented by pretreatment with LA.ConclusionsLA has protective effects on CS-exposed acute lung injury in mice by preventing CS-induced pulmonary inflammation，oxidative stress and protease rise.The exploration of the mechanisms suggests that LA exerts protective effects via suppressing ERK1/2/NF-κB pathways.

licorice；licochalcone A；lung injury；cigarette smoke；lung epithelial cell；cytokines；signal pathway

2016-01-07，修回日期：2016-02-02

浙江省教育廳科研項目（No Y201328230）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（No 2010ZY07）

任倩倩（1989-），女，碩士生，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail：61324680@qq.com；張水娟（1980-），女，博士，實驗師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：zsjdxw@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.011

A

1001-1978（2016）05-0643-09

R-332；R284.1；R163.1；R322.35；R563.902.5