吳　慧,盧虹玉,李梅婷,章超樺

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088)

?

亨氏馬尾藻醇提取物及其不同溶劑萃取物的抗氧化活性研究

吳慧,盧虹玉,李梅婷,章超樺*

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088)

研究了亨氏馬尾藻95%乙醇提取物不同溶劑級分的體外抗氧化活性。采用Folin-Ciocalteu法測定亨氏馬尾藻醇提取物(總提取物)以及石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物五個(gè)部位的總酚含量,并通過DPPH·、ABTS+·清除及ORAC三種方法評價(jià)五種提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明,乙酸乙酯萃取物的總酚含量最高,為(12.71±0.02) mg GAE/g(沒食子酸當(dāng)量)。在不同抗氧化測定方法中,亨氏馬尾藻醇提取物及其不同溶劑萃取物均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性。其中,乙酸乙酯萃取物抗氧化活性較強(qiáng),其DPPH和ABTS半數(shù)清除率分別為(0.89±0.01) mg/mL和(0.73±0.03) mg/mL,ORAC值達(dá)到(1803.78±81.37) μmol TE/g。

亨氏馬尾藻,抗氧化活性,ORAC,總酚

自由基是機(jī)體的代謝產(chǎn)物,正常的生理狀態(tài)下,自由基的形成和清除處于動態(tài)平衡,發(fā)揮著重要的生理作用。但是,機(jī)體內(nèi)過量的自由基具有強(qiáng)氧化性,損害機(jī)體組織和細(xì)胞,進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體衰老并且誘發(fā)各種疾病,而抗氧化劑能保護(hù)機(jī)體免受自由基誘導(dǎo)的氧化損傷[1-2]。由于合成的抗氧化劑對機(jī)體存在一定程度的損害,因此,從植物中提取有效的抗氧化物質(zhì)成為目前抗氧化劑發(fā)展的趨勢。植物中多糖、多酚類、黃酮類等化合物能夠清除過量自由基,表現(xiàn)較強(qiáng)抗氧化活性[3]。隨著近年對海洋資源的開發(fā)利用研究,海洋藻類在天然抗氧化劑方面的研究與開發(fā)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)和趨勢。

馬尾藻是褐藻中的一類海藻,種類豐富,廣泛分布于沿海地區(qū)。由于獨(dú)特且復(fù)雜的海洋環(huán)境,馬尾藻中積累了豐富的次生代謝產(chǎn)物,如多糖、多酚、甾醇等,前期研究表明,馬尾藻提取物具有顯著的抗氧化活性[4]。亨氏馬尾藻是一種廣泛分布于福建省和廣東省沿海地帶的海藻,資源豐富[5]。目前研究表明,亨氏馬尾藻成分豐富復(fù)雜,具有抗腫瘤和降血脂等生物活性[6-8],近年來的研究熱點(diǎn)集中在多糖方面,對其所含其它化學(xué)成分鮮見報(bào)道。本研究采用多種方法評價(jià)亨氏馬尾藻的醇提物(總提取物)及其不同極性溶劑萃取物的抗氧化能力和自由基清除能力,為促進(jìn)海藻資源在海洋天然抗氧化劑中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

亨氏馬尾藻2015年5月采自廣東湛江硇洲島,洗凈風(fēng)干,粉碎-20 ℃儲藏備用;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%,Tauto公司;二苯代苦味酰基(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)Sigma公司;Trolox純度≥98%,東京化成工業(yè)株式會社;熒光素二鈉鹽、2,2-偶氮雙-(2-甲基丙脒)-二鹽酸鹽(AAPH)均為Solarbio公司;抗壞血酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑;福林酚試劑北京鼎國生物技術(shù)有限公司;無水乙醇、無水碳酸鈉、過硫酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、正丁醇、乙酸乙酯、正丁醇均為市售分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

RT-34粉碎機(jī)榮聰精密科技有限公司;N-1000V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本EYELA公司;UV2550紫外分光光度計(jì)日本島津;Varioskan Flash全自動酶標(biāo)儀、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、微量移液器均為美國Themo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品溶液的提取和制備稱取亨氏馬尾藻粉500 g,用95%乙醇按料液比1∶10進(jìn)行室溫浸泡提取3次,依次浸泡12、24、48 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮得總提取物11.18 g。將總提物加6倍蒸餾水混懸后,以相同體積的石油醚進(jìn)行萃取后得到石油醚萃取物,水相再依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,每種溶劑分別萃取3次,合并萃取液濃縮干燥后分別得到石油醚萃取物2.32 g,乙酸乙酯萃取物1.83 g,正丁醇萃取物3.01 g,水萃取物3.31 g。取總提物以及各不同溶劑萃取物20 mg,用不同溶劑定容至10 mL(水萃取物用超純水,其他用無水乙醇),得到濃度為2 mg/mL的母液,分別用相應(yīng)溶劑稀釋,得到濃度為1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.2、0.25、0.2、0.125、0.0625 mg/mL的待測樣品溶液。

1.2.2總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[9]。根據(jù)文獻(xiàn)簡述如下:吸取質(zhì)量濃度5～60 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL,加入800 μL 1 mol/L福林酚乙液,振蕩混勻反應(yīng)5 min后,加入2 mL 12% Na2CO3溶液,混勻,室溫避光放置60 min,在760 nm處測定吸光度。重復(fù)三次,取平均值。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0186x+0.0215,R2=0.9997。將樣品稀釋到適當(dāng)濃度,按照相同的測定方法,測得吸光度值,根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出樣品總酚含量,以沒食子酸當(dāng)量(mg GA/g干基)計(jì)。

1.2.3清除DPPH自由基能力的測定參照文獻(xiàn)[10],吸取質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的總提取物以及不同溶劑萃取物待測溶液2 mL,分別加入5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液2 mL,迅速混勻,室溫暗處反應(yīng)30 min后,以相應(yīng)溶劑作為空白對照,在517 nm處測定吸光度A1。以相應(yīng)溶劑代替樣品溶液測定吸光度A0,以相應(yīng)溶劑代替DPPH溶液測定吸光度A2。VC作為陽性對照。樣品的抗氧化程度以對DPPH的清除率表示,清除率越大,抗氧化性越強(qiáng),反之,則越弱。清除率按以式(1)計(jì)算:

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

1.2.4清除ABTS+·自由基能力的測定參照文獻(xiàn)[11],將2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7.0 mmol/L ABTS溶液等體積混勻后,室溫避光反應(yīng)16 h,得到ABTS+自由基儲備液。用相應(yīng)溶劑將ABTS+自由基儲備液稀釋,使其吸光度值在波長734 nm處達(dá)到0.700±0.020,得到ABTS+自由基使用液。吸取質(zhì)量濃度為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的各待測樣品溶液40 μL于96孔板,分別加入160 μL ABTS+自由基使用液,混勻,室溫反應(yīng)8 min,在734 nm處測定吸光度A1。以相應(yīng)溶劑代替樣品溶液測定吸光度A0,以相應(yīng)溶劑代替ABTS+自由基使用液測定吸光度A2。VC作為陽性對照,樣品對ABTS+的清除率按公式(1)計(jì)算。

1.2.5氧自由基吸收能力測定(ORAC)參照文獻(xiàn)[12-14],將Trolox、AAPH和樣品溶解于磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中。取96孔板,依次加入20 μL稀釋到適當(dāng)濃度的樣品溶液后,每孔加入160 μL熒光素鈉鹽溶液,混勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)30 min后,迅速加入20 μL 153 nmol/L AAPH(現(xiàn)配現(xiàn)用),立即進(jìn)行熒光測定。設(shè)置時(shí)間間隔2.5 min,持續(xù)時(shí)間90 min,激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長538 nm,每次測定前震蕩8 s。不同濃度的Trolox(6.25～100 μmol/L)為陽性對照,磷酸鹽緩沖液為空白對照組(不加樣品),另設(shè)一組自身熒光對照組(不加AAPH)。將測得的數(shù)據(jù)輸入到Origin8.6中,采用積分法計(jì)算熒光衰退曲線下面積?？寡趸瘎┳饔孟聼晒馑ネ饲€面積(AUC樣品)和熒光自然衰退面積(AUC空白)之差net-AUC即抗氧化保護(hù)面積。以Trolox標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),net-AUC為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算netAUC樣品,ORAC值以Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g)。

表1　亨氏馬尾藻不同溶劑提取物的總酚含量

表2　不同溶劑提取物對DPPH·和ABTS+·的半數(shù)清除率IC50(mg/mL)

注:同一行不同字母表示有顯著差異(p<0.05)。

1.2.6數(shù)據(jù)處理采用Origin8.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,每次實(shí)驗(yàn)測定重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與討論

2.1總酚含量

酚類物質(zhì)通常存在于植物中,并且擁有抗氧化等多種生物活性,盧虹玉[15-16]等報(bào)道過硇洲馬尾藻與全緣馬尾藻中的多酚含量在0.01～2 mg GAE/g之間。亨氏馬尾藻總提物以及不同溶劑萃取物的總酚含量見表1。亨氏馬尾藻中總酚含量在3～13 mg GAE/g之間,高于硇洲馬尾藻與全緣馬尾藻的酚含量。由表1可知,亨氏馬尾藻95%醇提物以及不同極性溶劑萃取物之間的總酚含量存在差異。不同極性部位的總酚含量依次為:乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物>總提物>正丁醇萃取物>水萃取物。亨氏馬尾藻的酚類物質(zhì)主要集中在中等偏小的極性部位。

2.2DPPH·清除能力

DPPH在醇溶液中形成穩(wěn)定的紫色自由基,在517 nm處有最大吸收,遇到自由基清除劑時(shí),自由基濃度降低,紫色變淺,褪為淡黃色,吸光度值變小,以吸光度值的變化程度體現(xiàn)抗氧化能力[17]。

由圖1和表2可知,亨氏馬尾藻95%乙醇提取物以及不同溶劑萃取物對DPPH·均表現(xiàn)出清除作用,并且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,隨樣品濃度的增加,清除能力增強(qiáng)。由圖1可以看出,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對DPPH·清除效果相當(dāng),IC50分別為(0.94±0.03) mg/mL和(0.89±0.01) mg/mL,而總提物和正丁醇萃取物對DPPH·的清除率基本一致,清除率顯著(p<0.05)低于石油醚和乙酸乙酯萃取物,水萃取物的IC50為(2.11±0.11) mg/mL,清除作用最弱。質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),亨氏馬尾藻95%乙醇提取物對DPPH·的清除率為40.46%,遠(yuǎn)高于萱藻1.25 mg/mL 95%乙醇提取物對DPPH·的清除率26.63%[18],但是與VC相比,亨氏馬尾藻醇提物及不同溶劑萃取物對DPPH·的清除效果均不及VC。

圖1　不同溶劑提取物對DPPH·的清除率Fig.1　DPPH radical scavenging activity of different solvent extracts from S. henslowianum

2.3ABTS+·清除能力

樣品的抗氧化能力以ABTS+·的清除率表示,清除率越高,表示抗氧化能力越強(qiáng)。

由圖2和表2可知,亨氏馬尾藻95%乙醇提取物以及不同溶劑萃取物對ABTS+·均表現(xiàn)出不同程度的清除作用,而且隨著樣品濃度增加,對ABTS+·的清除率越大,不同極性部位對ABTS+·的清除率隨濃度的變化率存在差異。低濃度時(shí),總提物及不同極性部位的ABTS+·清除率相近,隨著濃度的增加,總提物的清除率顯著增強(qiáng),可能是因?yàn)榭偺崛∥锢锍煞謴?fù)雜,除了酚類物質(zhì)以外,還含有其他抗氧化物質(zhì),并且對ABTS有較強(qiáng)的清除作用[19],乙酸乙酯萃取物次之,可能與該部位含有較高含量的酚類化合物有關(guān)。其中,總提物和乙酸乙酯萃取物的IC50分別為(0.65±0.02) mg/mL和(0.73±0.03) mg/mL,雖顯著高于VC的IC50(0.055±0.02) mg/mL,但在濃度為2 mg/mL時(shí),仍然表現(xiàn)較高ABTS+·清除率,分別可以達(dá)到97.88%和81.07%。石油醚萃取物和正丁醇萃取物對ABTS的清除作用相當(dāng),IC50分別為(1.22±0.10) mg/mL和(1.29±0.14) mg/mL。水萃取物對ABTS自由基的清除作用最弱。

表3　不同溶劑提取物的ORAC值

注:不同字母表示有顯著差異(p<0.05)。

圖2　不同溶劑提取物對ABTS+·的清除率Fig.2　ABTS+ radical scavenging activity of different solvent extracts from S. Henslowianum

2.4ORAC測定結(jié)果

ORAC方法,又稱為氧自由基吸收能力或抗氧化能力指數(shù),是評價(jià)總抗氧化能力的方法之一,以AAPH熱分解產(chǎn)生過氧自由基,熒光素鈉劑(簡稱FL)為熒光指示劑,Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的分析方法。ORAC值越高,抗氧化能力越強(qiáng)。

由不同濃度Trolox的熒光衰退曲線得到圖3中相應(yīng)的Trolox濃度-效應(yīng)曲線。從表3可知,亨氏馬尾藻不同溶劑提取物的ORAC值大小依次為:乙酸乙酯萃取物>正丁醇提取物>石油醚萃取物=總提物>水萃取物。其中,乙酸乙酯萃取物為(1803.78±81.37) μmol TE/g,顯著高于醇提取物以及其他溶劑萃取物的ORAC值,遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[14]報(bào)道中銅藻(68.74±7.3) μmol TE/g和面條藻(66.15±10.10) μmol TE/g的ORAC值,表現(xiàn)出較強(qiáng)氧自由基吸收能力。

圖3　Trolox濃度-netAUC曲線Fig.3　Different concentrations of Trolox-netAUC curve

3　結(jié)論

通過研究亨氏馬尾藻95%乙醇提取物及不同極性溶劑萃取物的總酚含量并測定其體外抗氧化活性,結(jié)果表明亨氏馬尾藻不同極性部位的總酚含量在3～13 mg GAE/g之間,并且對DPPH·、ABTS+·有一定的清除能力,ORAC值在1000～2000 μmol TE/g范圍內(nèi)。其中,以乙酸乙酯萃取物的總酚含量最高,抗氧化活性較強(qiáng),極性最大的水萃取物總酚含量最低,抗氧化活性始終最弱。而酚類物質(zhì)作為抗氧活性的主要物質(zhì),酚類物質(zhì)含量越高,其抗氧化活性越強(qiáng),由此表明亨氏馬尾藻的酚類物質(zhì)和其他抗氧化活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯這種中等極性部位,因此,亨氏馬尾藻乙酸乙酯萃取物具有開發(fā)天然抗氧化物的潛力,可作為分離亨氏馬尾藻抗氧化成分的重點(diǎn)研究部位,進(jìn)而促進(jìn)亨氏馬尾藻海藻資源的有效利用。

[1]Circu M L,Aw T Y. Reactive oxygen species,cellular redox systems,and apoptosis[J]. Free Radical Biology Medicine,2010,48(6):749-762.

[2]Dudonne S,Vitrac X,Coutiere P,et al. Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH,ABTS,FRAP,SOD,and ORAC Assays[J]. Agricultural and Food Chemistry,2009,57(5):1768-1774.

[3]鄭瑞生. 植物中抗氧化活性成分及其提取技術(shù)的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(11):459-467.

[4]Liu Lei,Heinrich Michael,Myers Stephen,et al. Towards a better understanding of medicinal uses of the brown seaweedSargassumin traditional Chinese medicine:A phytochemical and pharmacological review[J]. Journal of Ethnopharmacology,2012,142(3):591-619.

[5]曾呈奎,陸保仁. 墨角藻[M]. 北京:科學(xué)出版社,1983:212-213.

[6]諶素華,王維民,劉輝,等. 亨氏馬尾藻化學(xué)成分分析及其營養(yǎng)學(xué)評價(jià)[J]. 食品研究與開發(fā),2010,31(5):154-156.

[7]李春蓮.低分子量亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的制備及抗腫瘤活性研究[D]. 湛江:廣東海洋大學(xué),2011.

[8]Cuong H D,Thuy T T T,Huong T T,et al. Structure and hypolipidaemic activity of fucoidan extracted from brown seaweedSargassumhenslowianum[J]. Natural Product Research,2014,29

(5):411-415.

[9]Silva J K,Cazarin C B B,Colomeu T C,et al. Antioxidant activity of aqueous extract of passion fruit(Passifloraedulis)leaves:Invitroandinvivostudy[J]. Food Research International,2013,53(2):882-890.

[10]魏玉西,于曙光. 兩種褐藻乙醇提取物的抗氧化活性研究[J]. 海洋科學(xué),2002,26(9):49-51.

[11]張小娜,鄒先偉,李瑩,等. 茯磚茶不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2014,11(10):9-13.

[12]何秋彤,余以剛,李聰聰,等. 20種市售涼茶類植物飲料抗氧化性的比較研究[J]. 食品科學(xué),2011,32(7):47-51.

[13]劉文旭. 草莓酚類物質(zhì)分離純化、生物活性和結(jié)構(gòu)的研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[14]Ishimoto H,Tai A,Yoshimura M,et al. Antioxidative properties of functional polyphenols and their metabolites assessed by an ORAC assay[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2012,76(2):395-399.

[15]盧虹玉,劉義,吉宏武,等. 全緣馬尾藻褐藻多酚的抗氧化和抗腫瘤細(xì)胞增殖作用研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013,29(4):702-705.

[16]盧虹玉,陳曉敏,毆小蕾,等. 硇洲馬尾藻(S.Naozhouense)褐藻多酚的抗凝血活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(2):249-252.

[17]許亞如. 褐藻多酚的抗氧化活性研究[D].寧波:寧波大學(xué),2014.

[18]欒莎. 萱藻(Scytosiphonlomentaria)抗氧化生物活性研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2012.

[19]霍麗妮,廖艷芳,陳睿,等. 狐貍尾不同極性溶劑提取物體外抗氧化活性研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(23):155-158.

Antioxidant properties of ethanol extractv and its different solvent fractions fromSargassumhenslowianum

WU Hui,LU Hong-yu,LI Mei-ting,ZHANG Chao-hua*

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center,Zhanjiang 524088,China)

In this research,antioxidant activitiy of different fractions from ethanol crude extracts ofS.henslowianumwas investigatedinvitro. The total phenolic contents of the 95% ethanol crude extracts and their four solvent fractions(viz.,petroleum ether(PE),ethyl acetate(EA),n-butanol and aqueous)were determined by Folin-Ciocalteu,and their antioxidant properties were evaluated using three assays including 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl(DPPH),2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate(ABTS)radical scavenging and oxygen radical absorbance capacity. The results showed that EA fraction had the highest content of total phenolics(12.71±0.02 mg gallic acid equivalents/g). All five fractions fromS.henslowianumexhibited the antioxidant activity. EA fraction exhibited strongest antioxidant activities among all the fractions,which the values of IC50based on DPPH· and ABTS+· were(0.89±0.01)mg/mL and(0.73±0.03)mg/mL respectively,and the values of ORAC was(1803.78±81.37) μmol Trolox equivalents/g.

S.henslowianum;antioxidant activitity;ORAC;phenols

2015-10-22

吳慧(1990-)，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用,E-mail:wh-fly@outlook.com。

章超樺(1956-)，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品及高值化利用,E-mail:zhangch2@139.com。

國家“863”項(xiàng)目(2013AA092902)。

TS254.4

A

1002-0306(2016)10-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.026