周　琴　張　勤　周素芽.浙江省人民醫(yī)院兒科，浙江杭州　3004；.杭州市兒童醫(yī)院新生兒科，浙江杭州　30006

TLR4在晚發(fā)型新生兒敗血癥中的意義

周琴1張勤1周素芽2
1.浙江省人民醫(yī)院兒科，浙江杭州310014；2.杭州市兒童醫(yī)院新生兒科，浙江杭州310006

目的探討Toll樣受體4（TLR4）對晚發(fā)型新生兒敗血癥診斷的臨床意義。方法選取2011年8月～2014年11月我院收治的血培養(yǎng)陽性的新生兒38例作為敗血癥組，根據感染病原體將其分為革蘭陽性菌感染組（G+組）23例，革蘭陰性菌感染組（G-組）15例，另選取我院同期收治的無感染性疾病的新生兒20例作為對照組，采集各組患兒外周血，應用密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞，采用RT-PCR法檢測TLR4 mRNA表達水平，免疫投射比濁法檢測血清CRP水平。比較組間各指標的差異，并分析兩者的相關性。結果 G+組與G-組TLR4 mRNA及CRP水平與對照組相比均明顯升高（P<0.01）；CRP在G+組與G-組兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；G-組TLR4 mRNA的表達明顯高于G+組（P<0.05）。TLR4與CRP呈正相關（r=0.749，P＜0.01）。結論TLR4可以作為診斷晚發(fā)型新生兒敗血癥的有效指標，尤其對于識別革蘭陰性菌感染更有意義。

Toll樣受體4；C反應蛋白；新生兒；敗血癥

[Abstract]Objective To investigate the clinical significance of toll-like receptor 4(TLR4)in the diagnosis of late-onset neonatal septicemia.Methods A total of 38 newborns with positive blood culture who were admitted from August 2011 to November 2014 were selected as the septicemia group.According to the infection pathogens,the newborns were divided into gram positive bacteria infection group(G+)with 23 cases,gram negative bacteria infection group(G-)with 15 cases and 20 newborns without infectious diseases from the same period of time were selected as the control group. The peripheral blood of the newborns was collected and peripheral blood mononuclear cells were isolated with the density gradient centrifugation.The expression level of TLR4 mRNA was detected with RT-PCR method and serum CRP level was detected with immunity transmission turbidity.Compare the differences of each index of the two groups and analyze the correlation of the two groups.Results G+group and G-group both had significant higher TLR4 mRNA and CRP level compared with that of the control group(P<0.05);the difference of CRP level of the G+group and G-group had no statistical significance(P>0.05);the TLR4 mRNA level of G-group was significantly higher than that of the G+group(P<0.05).TLR4 and CRP had positive correlation(r=0.749,P<0.01).Conclusion TLR4 can be taken as the effective index in the diagnosis of late-onset neonatal septicemia,especially for the identification of G+infection.

[Key words]Toll-like receptor 4;C-reactive protein;Newborn;Septicemia

新生兒免疫系統(tǒng)未成熟，免疫功能較差，極易發(fā)生細菌感染，發(fā)生感染后很難局限而導致敗血癥[1]。新生兒敗血癥早期臨床表現不典型，病情發(fā)展迅速，是新生兒死亡的重要原因[2]，因此選取敏感性、特異性高的指標對新生兒敗血癥的早期診斷具有非常重要的意義。雖然C反應蛋白（C-reaction protein，CRP）是新生兒敗血癥經典的指標之一，但其仍缺乏一定的特異性[3]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，可與病原識別模式分子結合，通過介導細胞信號轉導致炎癥因子釋放，從而識別病原微生物、啟動炎癥應答[4]。為了探討TLR4與 CRP在晚發(fā)型新生兒敗血癥中的表達及其臨床價值，本研究選取了我院收治的患敗血癥新生兒進行檢測，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2011年8月～2014年11月浙江省人民醫(yī)院新生兒科收治的血培養(yǎng)陽性的新生兒38例作為敗血癥組，所有患兒均于出生7 d后發(fā)病，且符合新生兒敗血癥相關診斷標準[5]。38例患兒中，男21例，女17例，胎齡37～42周，日齡8～28 d，平均（19.2±5.4）d。根據血培養(yǎng)結果將其分為革蘭陽性菌組（G+組）23例，其中表皮葡萄球菌13例，溶血性葡萄球菌7例，金黃色葡萄球菌3例；革蘭陰性菌組（G-組）15例，其中大腸埃希菌 6例，肺炎克雷伯桿菌5例，鮑曼不動桿菌4例。另選取我院同期收治的無感染性疾病的新生兒20例作為對照組，其中男12例，女8例，日齡8～28 d，平均（20.1±5.7）d。各組之間在出生體重、日齡以及胎齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2實驗儀器與試劑

TRI Reagent總RNA提取試劑盒（TR-118）為MRI公司產品，RT-PCR試劑盒（DRR023A）購自TaKaRa公司。Ficoll分離液（CL5020）購自上海普飛生物技術有限公司。RT-PCR儀為Biometra Germen公司產品。CRP檢測采用邁瑞公司BECKMAN生化儀。

1.3標本收集與處理

敗血癥組患兒使用抗生素前，于清晨空腹抽取2 mL靜脈血，取0.5 mL用免疫投射比濁法檢測CRP的水平；1.5 mL加入Ficoll分離液，采用密度梯度離心法以3500 rpm/min，時間20 min，分離外周血單個核細胞[6]。加入Trizol提取總RNA，隨后放于-70℃凍存。對照組患兒于空腹采集2 mL外周靜脈血，標本處理同上。

1.4RT-PCR法檢測TLR4 mRNA

逆轉錄反應按TaKaRa公司試劑盒說明書進行。用β-actin作為內參照，引物序列及反應條件：①βactin：5’-CTACAATGCTGCGT GTGG-3’，5’-ATGGC TACGTACATGGCTGG-3’，產物長度138 bp；②TLR4：5’-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3，5’-ATGGGT TTTAGGCGCAGAGTTT-3’；94℃3 min后，94℃30 s，59℃30 s，72℃1 min，循環(huán)32次，72℃延伸5 min終止，產物長度356 bp。用SmartView分析產物光密度值，以TLR4條帶與β-actin的光密度值比，作為其mRNA水平的指標。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以（x±s）表示，G+組與G-組和對照組比較采用單因素方差分析，G+組與G-組比較用LSD檢驗，TLR4與CRP的相關性采用Pearson等級相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1三組新生兒TLR4 mRNA、CRP水平檢測水平比較

與對照組比較，G+組與G-組新生兒TLR4 mRNA 及CRP水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；CRP在G+組[（46.92±18.69）mg/L]與G-組[（55.70± 26.97）mg/L]兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；TLR4 mRNA在G-組（1.94±0.23）的表達明顯高于 G+組（1.78±0.26），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2TLR4與CRP的相關性分析

TLR4 mRNA的含量與CRP的水平呈正相關（r= 0.749，P＜0.01）。

表1　三組新生兒TLR4 mRNA與CRP水平比較（x±s）

3　討論

新生兒由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，特異性與非特異性免疫反應均較差，因此對感染普遍易感，且感染后不能有效清除體內病原體，容易擴散形成敗血癥[7]。同時新生兒敗血癥早期缺乏典型的臨床表現，多為不哭、不動、嗜睡、反應力低下等，因此不易被及時診斷[8]。血培養(yǎng)是確診敗血癥的金標準，但陽性率低，且至少需要48 h才能得到結果，不能進行早期診斷。因此，迫切需要尋找一種準確而快速診斷新生兒敗血癥的實驗室指標。

CRP是一種急性時相反應蛋白，主要是由肝臟合成，其含量在機體炎癥反應或組織損傷時明顯增加，是非特異性炎性指標[9]。CRP可在新生兒感染后在6 h內迅速增加，達峰于48 h，半衰期約19 h，高峰可為正常值的100~1000倍[10]。CRP可在敗血癥的過程中持續(xù)升高，但其亦可在腫瘤、其他免疫性疾病中升高，故缺乏一定的特異性[11]。且我們實驗發(fā)現，CRP的表達在G+與G-細菌感染之間無差異，這對于我們臨床在區(qū)分可能的病原菌感染及選擇抗生素時，帶來了一定的困難。我們實驗還發(fā)現在CRP上升的同時，TLR4的表達也逐漸增加，兩者呈現明顯的正相關。那么在敗血癥的新生兒患兒中檢測TLR4是否可以作為CRP的補充指標呢？

TLRs最早由果蠅體內分離得到，是一類與免疫系統(tǒng)識別微生物有關的細胞膜跨膜受體，是機體抵抗病原體的屏障，在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[12]。當細胞外病原體相關分子模式配體與 TLRs結合后，又可激活特異性免疫[13]。TLR4是首個在人類細胞表面發(fā)現的TLR，主要表達于單核巨噬細胞膜上，可識別革蘭陰性菌的細胞壁成分：如脂多糖、脂磷壁酸等，激活后可產生炎性細胞因子及效應因子，進一步活化放大炎癥反應，從而有效清除病原體[14，15]。王琳等[16]認為，新生兒尤其早產兒TLR表達低下，可能是新生兒免疫功能差、易患新生兒敗血癥等感染性疾病的原因之一。Kollmann等[17]發(fā)現在晚發(fā)型新生兒敗血癥患兒體內，TLR通過識別細菌表面的脂多糖成分活化單核巨噬細胞系統(tǒng)，從而激活絲裂原蛋白活化激酶，發(fā)揮清除細菌的作用。Redondo等[18]在血培養(yǎng)陽性的敗血癥新生兒的單核細胞中發(fā)現TLR4的表達明顯升高，且在革蘭陰性菌組TLR4的升高更加明顯，但TLR2的表達水平與對照組相比卻無明顯上升。張金萍等[19]研究發(fā)現，新生兒敗血癥組TLR2與TLR4均明顯增高，且TLR2在革蘭陽性菌感染時升高明顯，而革蘭陰性菌感染時TLR4顯著增高。

我們的實驗結果發(fā)現，革蘭陰性菌感染組TLR4 mRNA的表達明顯高于革蘭陽性菌感染組，這一結果與文獻報道相符[20]，其機制可能與TLR4能識別脂多糖等革蘭陰性菌細胞壁成分相關。這一結果也提示，在可疑新生兒敗血癥的患兒早期檢測CRP的同時，測定TLR4的水平，不僅能作為判斷敗血癥感染的指標，而且TLR4的明顯升高更能提示革蘭陰性菌感染的可能性，為在取得血培養(yǎng)結果之前經驗性選擇抗生素提供有力的實驗保障。

綜上所述，TLR4可以作為診斷晚發(fā)型新生兒敗血癥的有效指標，尤其對于識別革蘭氏陰性菌感染更有意義。但我們仍需研究發(fā)生新生兒敗血癥時TLR4的下游信號通路轉導途徑，進一步研究是否可以通過抑制其活化，來達到控制炎癥瀑布反應的產生，從而為臨床治療新生兒敗血癥帶來新的思路和理論依據。

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Significance of TLR4 in the late-onset neonatal septicemia

ZHOU Qin1ZHANG Qin1ZHOU Suya2
1.Department of Pediatrics,Zhejiang People's Hospital,Hangzhou310014,China;2.Department of Neonatology, Hangzhou Children's Hospital,Hangzhou310006,China

R722.1

A

1673-9701（2016）12-0011-03

浙江省中醫(yī)藥科學研究基金計劃（2011ZB014）

2016-01-04）