馮　霞,趙　欣,*

(1.重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067;2.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067)

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不同容器發(fā)酵水豆豉預防CCl4誘導肝損傷的研究

馮霞1,2,趙欣1,2,*

(1.重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067;2.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067)

本研究對不同容器發(fā)酵水豆豉的抗氧化能力以及肝損傷預防效果進行了研究。和肝損傷組小鼠相比(CCl4誘導肝損傷),濃度為4 g/kg的水豆豉乙醇提取物處理的各組小鼠的肝臟重量,肝指數(shù),血清ALT、AST、LDH、MDA、IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平顯著降低(p<0.05),SOD、GSH-Px的水平顯著提高(p<0.05)。通過RT-PCT實驗也可以看出較肝損傷組水豆豉可以上調(diào)小鼠肝臟的Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT的表達,下調(diào)iNOS、COX-2、IL-lβ、TNF-α表達。通過實驗結果可以看出,玻璃容器發(fā)酵水豆豉(GVFS)的肝損傷預防效果和抗氧化效果顯著優(yōu)于陶瓷容器發(fā)酵水豆豉(CVFS)和塑料容器發(fā)酵水豆豉(PVFS)(p<0.05)。

水豆豉,容器,CCl4,肝損傷,抗氧化

水豆豉是我國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品,大豆通過短時間的發(fā)酵制成水豆豉,在西南地區(qū)水豆豉常作為調(diào)味品使用。同時,在中國古代醫(yī)書上對水豆豉的功效也有記載,水豆豉也作為一味中藥使用,具有開胃健脾,清熱解毒等功效;現(xiàn)代科學也證明水豆豉可作為功能性食品使用,有抗氧化、抗突變和預防癌癥等功效[1]。水豆豉是通過細菌進行自然發(fā)酵的大豆制品,浸泡水量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、后發(fā)酵時間等都能影響其理化性質(zhì)和功能性作用[2],發(fā)酵容器的材質(zhì)也可導致發(fā)酵溫度、水分等因素產(chǎn)生差異,從而使大豆產(chǎn)品的發(fā)酵過程出現(xiàn)差別,影響其品質(zhì)[3]。家庭發(fā)酵水豆豉常使用玻璃、陶瓷和塑料容器。在韓國有研究表明,發(fā)酵容器的差異對發(fā)酵大豆食品(大醬)的品質(zhì)產(chǎn)生了影響,造成產(chǎn)品的品質(zhì)出現(xiàn)較大差別[4]。

急性肝損傷是一種急性肝功能異常的病理狀況,四氯化碳(CCl4)是一種可以造成急性肝損傷的化學物質(zhì),被常用于基礎科學研究[5]。四氯化碳對肝臟的損傷作用與氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應有密切關系,當CCl4進入肝臟后,通過細胞色素P450的激活,生成OOCCl3·和OOCCl3·這兩種自由基,在體內(nèi)引起脂質(zhì)過氧化反應,對肝細胞膜的產(chǎn)生損害,影響肝臟的結構和功能,同時造成Ca2+內(nèi)流,進一步損傷肝細胞,加重肝損傷[6]。另外,CCl4還通過其代謝產(chǎn)物刺激肝臟枯否細胞大量釋放促炎性細胞因子,使肝損傷的程度增加[7]。研究表明,水豆豉也具有較好的抗氧化效果[8],因此水豆豉可能通過其抗氧化能力起到預防和抑制CCl4誘導造成的肝損傷。本研究對塑料、陶瓷、玻璃這三種常用容器對水豆豉的肝損傷預防效果進行比較,并驗證水豆豉的肝損傷預防作用與其抗氧化能力之間的關系。研究結果可以積累水豆豉發(fā)酵容器造成品質(zhì)變化的理論依據(jù),便于指導工業(yè)化生產(chǎn)水豆豉。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大豆黑龍江省嫩江縣黑龍江農(nóng)墾總局大西江農(nóng)場出產(chǎn)(2014年秋季)。

丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)南京建成生物工程研究所;IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ細胞因子美國BioLegend公司;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒德國Becton Dickinson公司;Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV美國Invitrogen公司;RT-PCR引物iNOS、COX-2、IL-lβ、TNF-α、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT天根生化科技有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

雄性SPF級昆明小鼠50只(6周齡,體重20～25 g,動物許可證號:SCXK(渝)2012-0001)購自于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。

LD2X-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋江西華科精密儀器有限公司;PYX-DHS-50X65BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海百典儀器設備有限公司;UV9600紫外分光光度計北京北分瑞利分析儀器(集團)公司;Bio-Rad小型水平電泳槽美國Bio-Rad公司;ABI 2720 PCR儀美國Applied Biosystems公司。

1.2實驗方法

1.2.1不同容器發(fā)酵水豆豉及提取精選后的大豆與蒸餾水按1∶2比例(重量比)浸泡12 h,然后將大豆放置于高壓蒸氣滅菌鍋中蒸煮(105℃,60 min)。將蒸煮后的大豆冷卻至36℃后置于陶瓷、塑料和玻璃容器中放入恒溫培養(yǎng)箱中保溫發(fā)酵(36℃,72 h)。將發(fā)酵完成后的水豆豉進行冷凍干燥然后粉碎,加入20倍量的80%乙醇(v/v)提取12 h,重復提取3次并合并提取液,用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干溶劑得到水豆豉提取物待用。

1.2.2動物誘導肝損傷實驗將KM小鼠喂養(yǎng)1周適應環(huán)境后隨機平均分為5組,分別是對照組、肝損傷組、陶瓷容器發(fā)酵水豆豉(CVFS)喂養(yǎng)組、塑料容器發(fā)酵水豆豉(PVFS)喂養(yǎng)組和玻璃容器發(fā)酵水豆豉(GVFS)喂養(yǎng)組,每組10只小鼠。正常組和對照組小鼠在3周實驗過程中每天灌胃0.2 mL蒸餾水,CVFS、PVFS和GVFS喂養(yǎng)組小鼠每日按濃度4 g/kg分別灌胃0.2 mL陶瓷容器發(fā)酵水豆豉、塑料容器發(fā)酵水豆豉和玻璃容器發(fā)酵水豆豉組提取物溶液,持續(xù)3周。3周后對除對照組外其余各組小鼠實施絕食24 h后腹腔皮下注射CCl4(0.2 mL,CCl4∶橄欖油=1∶1),取心臟血及肝臟待用[5],同時測定其中肝指數(shù),指數(shù)按公式計算:肝指數(shù)=(小鼠肝臟重量/小鼠體重)×100。

1.2.3小鼠血清指標檢測將取得的小鼠血漿在4000 r/min下離心分離10 min后取上層血清,按試劑盒說明書測定小鼠血清中ALT、AST、LDH、SOD、GSH-Px和MDA的含量。

1.2.4小鼠細胞因子檢測將取得的小鼠血漿在4000 r/min下離心分離10 min后取上層血清,按試劑盒說明書使用ELISA測定小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ的細胞因子水平。

1.2.5用RNAzol試劑提取各組小鼠肝臟組織中的總RNA,然后將其濃度稀釋到1 μg/μL。在2 μL RNA 提取液中按次序分別加入1 μL的 oligodT18、RNase、dNTP、MLV 酶和10 μL的 5×buffer,然后合成cDNA(條件為:37℃ 120 min,99℃ 4 min,4℃ 3 min)。然后以反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增iNOS(上游引物:5′-AGA GAG ATC GGG TTC ACA-3′;下游引物:5′-CAC AGA ACT GAG GG TAC A-3′)、COX-2(上游引物:5′-TTA AAA TGA GAT TGT CCG AA-3′;下游引物:5′-AGA TCA CCT CTG CCT GAG TA-3′)、IL-lβ(上游引物:5′-CTC CAT GAG CTT TGT ACA AGG-3′;下游引物:5′-TGC TGA TGT ACC AGT TGG GG-3′)、TNF-α(上游引物:5′-CTC CCT CCA GAA AAG ACA CCA T-3′;下游引物:5′-ATC ACC CCG AAG TTC AGT AGA CAG-3′)、Mn-SOD(上游引物:5′-TTC AAT AAG GAG CAG GGA C-3′;下游引物:5′-CAG TGT AAG GCT GAC GGT TT-3′)、Gu/Zn-SOD(上游引物:5′-GAA GAG AGG CAT GTT GGA GA-3′;下游引物:5′-CCA ATT ACA CCA CGA GCC AA-3′)和CAT(上游引物:5′-AGA TAC TCC AAG GCG AAG GTG-3′;下游引物:5′-AAA GCC ACG AGG GTC ACG AAC-3′)的mRNA表達,同時GAPDH(持家基因,上游引物:5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TC-3′；下游引物5′-AGC CTT CTC CAT GGT CGT GA-3′)作為內(nèi)參照同樣進行擴增。最后以瓊脂(含1%濃度溴化乙錠)電泳檢查PCR擴增產(chǎn)物,并用Image1.44軟件定量分析表達強度[9]。

1.2.6活性大豆異黃酮的測定將活性大豆異黃酮(大豆黃素和金雀異黃素)標準品溶于80%的乙醇中,配制成濃度為0.002～0.020 g/L的標準溶液。以Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×25 mm,5 μm);流動相﹕40%甲醇;流速為1.0 mL/min;檢測器靈敏度為0.02AUFS;檢測波長為260 nm;柱溫為50℃;取標準溶液20 μL注入六通閥中,測定峰面積。求得回歸方程為Y大豆黃素=148338+1.70×108X(r=0.999);Y金雀異黃素=-316706+4.20×108X(r=0.995),得到標準曲線。取不同容器發(fā)酵水豆豉樣品2 g,粉碎后加10倍量的蒸餾水稀釋后4000 r/min離心取上清液,在80℃烘箱中干燥烘干。干燥物用200 mL的80%乙醇在恒溫水浴(80℃)中回流提取兩次,每次2 h,然后合并提取液,減壓蒸干,用無水乙醇定容至10 mL作為待測液,將待測液測定后對照標準曲線得到水豆豉中活性大豆異黃酮的含量[10]。

表2　實驗小鼠血清的ALT、AST和LDH水平

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對所有的實驗進行3次平行實驗,然后將3次實驗結果取平均值,使用SAS9.1統(tǒng)計軟件采用one-way ANOVA 分析方法分析各組數(shù)據(jù)在p<0.05水平上是否具有顯著差異[9]。

2　結果與分析

2.1不同容器發(fā)酵水豆豉對小鼠肝指數(shù)的影響

由表1可知,誘導肝損傷后CCl4處理各小鼠的體重較對照組小鼠有所下降,肝損傷組小鼠下降最多,水豆豉處理各組小鼠的體重沒有顯著差異(p>0.05)。CCl4處理各小鼠的肝臟重量較對照組小鼠顯著增加(p<0.05),灌胃水豆豉提取物各組小鼠的肝臟重量比肝損傷組小鼠小,GVFS可以最大的緩解CCl4造成的肝組織重量上升。通過測得的小鼠體重和肝臟重量加以計算觀察到肝損傷組小鼠的肝指數(shù)顯著高于其他各組(p<0.05),對照組小鼠最低,GVFS、PVFS和CVFS喂養(yǎng)組小鼠的肝指數(shù)依次增加。肝損傷狀態(tài)下,小鼠體重會出現(xiàn)下降,肝臟重量會增加,導致肝指數(shù)較正常小鼠大大提高[11],本實驗也得到相似的結果,CCl4導致小鼠體重下降,肝臟重量增加,肝指數(shù)上升,水豆豉可以顯著緩解這些現(xiàn)象,且GVFS的作用較另外兩種容器發(fā)酵的水豆豉效果更好。

2.2不同容器發(fā)酵水豆豉對小鼠血清ALT、AST和LDH水平的影響

AST和ALT都是轉氨酶,肝功能出現(xiàn)異常時在體內(nèi)會出現(xiàn)顯著變化,臨床上常用檢測血清中的AST、ALT 的酶學指標來判斷肝功能是否正常,ALT 和AST在正常情況下穩(wěn)定的分別分布在肝細胞漿和肝細胞的細胞漿、線粒體中,肝臟受損時AST,ALT 釋放入血液中使血液中的AST,ALT水平出現(xiàn)異常的上升[11]。LDH是一種在體內(nèi)廣泛分布的酶,在肝臟中也有大量的分布,在肝臟損傷情況下,肝組織中的LDH水平會出現(xiàn)異常的大幅度上升,因此LDH在肝臟中的水平也作為肝損傷的重要評價指標[5]。由表2可知,肝損傷組小鼠的血清ALT、AST和LDH水平顯著高于其他各組(p<0.05),對照組小鼠的ALT、AST和LDH水平最低。GVFS、PVFS和CVFS喂養(yǎng)可以緩解CCl4導致的ALT、AST和LDH水平上升,且GVFS的效果最明顯。

表1　實驗小鼠的體重、肝臟重量和肝指數(shù)

注:CVFS,陶瓷容器發(fā)酵水豆豉;PVFS,塑料容器發(fā)酵水豆豉;GVFS,玻璃容器發(fā)酵水豆豉。不同字母表示各組數(shù)據(jù)平均值之間存在顯著性差異(p<0.05),表2～表4,圖1、圖2同。

2.3不同容器發(fā)酵水豆豉對小鼠血清SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

SOD和GSH-Px都是體內(nèi)重要的抗氧化功效物質(zhì),SOD和GSH-Px在血清中的含量高意味體內(nèi)受到氧化損傷的程度低;MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的重要表現(xiàn),其異常升高代表體內(nèi)受到嚴重的脂質(zhì)過氧化[12]。CCl4在肝臟中導致脂質(zhì)過氧化,損傷肝臟組織[6]。由表3可知,對照組小鼠血清中SOD、GSH-Px含量最高,MDA含量最低;肝損傷組小鼠呈現(xiàn)出相反的趨勢,血清中的SOD、GSH-Px含量最低,MDA含量最高。GVFS喂養(yǎng)組小鼠的SOD、GSH-Px含量顯著高于PVFS和CVFS喂養(yǎng)組,MDA含量顯著低于PVFS和CVFS喂養(yǎng)組(p<0.05)。GVFS喂養(yǎng)后,較CCl4誘導肝損傷組,小鼠的血清SOD、GSH-Px水平升高,MDA水平下降,GVFS可能通過降低體內(nèi)受氧化程度,從而起到抑制和預防肝損傷的作用。

2.4不同容器發(fā)酵水豆豉對小鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平的影響

IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子都是重要的炎癥因子,機體出現(xiàn)肝損傷導致的炎癥后這些細胞因子顯示出比正常狀態(tài)下更高的水平[13]。本實驗中也得到相似的結果,CCl4導致肝臟損傷并出現(xiàn)炎癥,由表4可知,肝損傷組的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平最高,水豆豉可以使各組受到CCl4作用的小鼠細胞因子水平下降,GVFS使這些細胞因子在小鼠體內(nèi)下降的程度最大。

表3　實驗小鼠血清的SOD、GSH-Px和MDA水平

2.5不同容器發(fā)酵水豆豉對小鼠肝臟中iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-α的mRNA表達的影響

COX-2 是一種肝細胞受損后表達會異常上升的誘導酶,在CCl4導致的肝損傷中,COX-2 的表達比正常小鼠大幅度提高;iNOS 和COX-2在CCl4致肝損傷的情況下表達呈正相關,iNOS表達也上升[13]。IL-lβ和TNF-α也是重要的炎癥相關基因,在正常人群的肝臟中表達不明顯,在肝損傷情況下出現(xiàn)強烈的表達[14]。由圖1可知,對照組小鼠肝臟中的iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-αmRNA表達最弱,肝損傷組小鼠最高。水豆豉可以顯著下調(diào)肝損傷小鼠肝臟中的iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-α表達,且GVFS下調(diào)的幅度最大,GVFS喂養(yǎng)組小鼠肝臟中的iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-α表達僅為肝損傷組小鼠的0.21、0.65、0.32和0.66倍。iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-α均可作為肝損傷的治療靶點,GVFS可以顯著降低肝組織中的iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-α表達,起到抑制肝損傷的作用。

圖1　不同容器發(fā)酵水豆豉灌胃小鼠肝臟中iNOS、COX-2、IL-lβ和TNF-α表達水平Fig.1　mRNA expression levels of iNOS,COX-2,IL-lβ and TNF-α in liver of different vessels fermented Shuidouchi intragastric administrated mice

表4　實驗小鼠血清的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平

2.6不同容器發(fā)酵水豆豉對小鼠肝臟中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達的影響

SOD在動物體存在三種異構體,分別是Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和EC-SOD,體內(nèi)低水平的Mn-SOD和Gu/Zn-SOD會造成自由基的大量產(chǎn)生,加劇肝損傷程度。CAT作為生物防御體系中的一種關鍵酶,可以清除體內(nèi)的氧自由基和促進過氧化氫分解,從而避免CCl4導致肝臟損傷后產(chǎn)生的大量氧自由基加劇肝損傷[15]。由圖2可知,對照組小鼠肝臟中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達最強,CCl4可導致這些表達顯著下降(p<0.05),不同容器發(fā)酵水豆豉的提取物可以顯著緩解這些表達在肝臟中下降,且GVFS的緩解作用最為強烈,GVFS組小鼠肝臟中的Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT表達達到肝損傷組小組的1.95、14.33和1.40倍,高于PVFS和CVFS組。由此可見,水豆豉可以通過加強肝組織中的抗氧化表達來緩解和抑制肝損傷,而GVFS的作用最優(yōu),即采用玻璃發(fā)酵的水豆豉具有更好的效果。

圖2　不同容器發(fā)酵水豆豉灌胃小鼠肝臟中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT表達水平Fig.2　mRNA expression levels of Mn-SOD,Gu/Zn-SOD and CAT in liver of different vessels fermented Shuidouchi intragastric administrated mice

2.7不同容器發(fā)酵水豆豉的活性異黃酮含量比較

活性大豆異黃酮具有較強的抗氧化效果,也具有抑制炎癥的作用[16]。經(jīng)過檢測可知不同容器發(fā)酵的水豆豉中的活性大豆異黃酮(大豆黃素和金雀異黃素)含量具有顯著差異,GVFS的大豆黃素和金雀異黃素含量均顯著(p<0.05)高于PVFS和CVFS。GVFS的抗氧化效果和肝損傷預防效果優(yōu)于PVFS和CVFS的原因可能來源于其活性大豆異黃酮高于PVFS和CVFS。

表5　不同容器發(fā)酵水豆豉中大豆黃素和金雀異黃素的含量

3　結論

對不同容器發(fā)酵水豆豉的通過其抗氧化能力對CCl4誘導肝損傷的預防效果進行了研究,通過小鼠體內(nèi)實驗證明了不同容器發(fā)酵水豆豉間抗氧化能力有所差異,且產(chǎn)生的肝損傷預防效果也有顯著差異。GVFS喂養(yǎng)的肝損傷小鼠的肝指數(shù)、血清的ALT、AST、LDH、MDA、IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平顯著低于CVFS、PVFS組;血清中SOD、GSH-Px顯著高于CVFS、PVFS組(p<0.05)。通過RT-PCR分析肝組織看出GVFS可以下調(diào)iNOS、COX-2、IL-lβ、TNF-α表達和上調(diào)Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT表達,且作用同樣強于CVFS和PVFS。對水豆豉中活性大豆異黃酮含量進行了比較,可以看出GVFS含有的大豆黃素和金雀異黃素顯著高于PVFS和CVFS。實驗結果可以體現(xiàn)出GVFS通過抗氧化能力起到的肝損傷抑制作用強于CVFS和PVFS,玻璃容器用來發(fā)酵水豆豉可以生產(chǎn)出保健功效更好的水豆豉產(chǎn)品。

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Study on preventive effects of different vessels fermented Shuidouchi on CCl4induced hepatic damage

FENG Xia1,2,ZHAO Xin1,2,*

(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 2.Chongqing Collaborative Innovation Center of Functional Food, Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

The antioxidation and hepatic damage preventive effects of different vessels fermented Shuidouchi were investigated.The 4 g/kg Shuidouchi ethanol extracts treated mice could significantly(p<0.05)reduce the liver weight,liver index,serum levels of ALT,AST,LDH,MDA,IL-6,IL-12,TNF-α,IFN-γ,and significant(p<0.05)raise the SOD,GSH-Px serum levels compared to the hepatic damage group mice(CCl4induced hepatic damage).By the RT-PCR assay,Shuidouchi could increase the Mn-SOD,Gu/Zn-SOD,CAT expressions and decrease iNOS,COX-2,IL-lβ,TNF-αexpressions compared to the control mice.From these results,the glass vessel fermented Shuidouchi(GVFS)had the better hepatic damage preventive effects and antioxidation effects than ceramic vessel fermented Shuidouchi(CVFS)and plastic vessel fermented Shuidouchi(PVFS)(p<0.05).

Shuidouchi;vessel;CCl4;hepatic damage;antioxidant

2015-09-07

馮霞(1976-)，女，碩士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)和功能性食品，E-mail:fengxia@foods.ac.cn。

趙欣(1981-)，男，博士，教授，研究方向：食品的功能性作用，E-mail:zhaoxin@zhaoxin.org。

重慶市教委科學技術研究項目資助(KJ1401415)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)07-0338-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.056