高速逆流色譜分離純化雪白睡蓮花中的酚類成分

買吾拉江·阿不都熱衣木，李晨陽，李 倩，徐 芳，吉騰飛，趙 軍*

(1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆烏魯木齊 830004；3，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所天然藥物活性成分與功能國家重點實驗室，北京100050)

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高速逆流色譜分離純化雪白睡蓮花中的酚類成分

買吾拉江·阿不都熱衣木1，李晨陽2，李 倩1，徐 芳2，吉騰飛3，趙 軍2*

(1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆烏魯木齊 830004；3，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所天然藥物活性成分與功能國家重點實驗室，北京100050)

[目的] 采用高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化雪白睡蓮花中的酚類成分。[方法] HSCCC分離過程分為兩步，分別采用乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)兩個體系，固定相均采用上相，流動相均采用下相，流速為2.0 mL/min，主機轉速設定為850 r/min，紫外檢測波長為254 nm。高效液相色譜(HPLC)檢測純度。[結果] 第一步從200 mg 的睡蓮花提取物中分離得到異槲皮苷(I，41.4 mg)、紫云英苷(II，40 mg)和一混合物85 mg；第二步從混合物中分離純化得到isostrictiniin(III，50.1 mg)和煙花苷(IV，26.3 mg)，上述4種物質的純度分別為73.53%、92.42%、82.36%和85.65%。[結論] HSCCC可快速的分離純化雪白睡蓮花中的酚類成分。

雪白睡蓮花；高速逆流色譜；酚類成分

雪白睡蓮花為睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾，主要分布于我國新疆的伊犁、阿勒泰和博湖地區(qū)。該植物為維吾爾醫(yī)習用藥材，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神之功效，在臨床上主要用于熱癥引起的頭痛、熱感咳嗽及小兒急、慢驚風等病癥的治療[1]，收載于《中華人民共和國藥品標準維吾爾藥分冊》等醫(yī)藥文獻中[2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，睡蓮屬植物具有抗氧化、抗肝炎、降血壓、降血糖等多種生物活性[3-5]。煙花苷等酚類化合物是該屬植物的主要特征性成分[6]。然而目前為止對睡蓮花中該類成分的快速分離卻鮮見文獻報道。因此，為了該藥材質量標準及其相關對照品的研究，需要建立有效成分快速高效的分離純化方法。高速逆流色譜(High speed counter-current chromatography，HSCCC)具有分離速度快、樣品損失小的特點，是近年來廣泛用于天然有效成分分離純化的色譜技術[7-10]。筆者在前期研究基礎上運用HSCCC方法從200 mg雪白睡蓮花提取物中分離得到了4種化合物，分別為異槲皮苷(圖1 I，41.4 mg)、紫云英苷(圖1 II，40mg)、isostrictiniin(圖1 III，50.1 mg)和煙花苷(圖1 IV，26.3 mg)，其純度分別為73.53%、92.42%、82.36%和85.65%，旨在為睡蓮花質量控制方法的建立提供依據(jù)。

圖1　睡蓮花中酚類成分的化學結構Fig.1　Chemical structures of phenolic compounds from Nymphaea candida

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材。雪白睡蓮花藥材購自新疆維吾爾藥業(yè)有限公司，由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為雪白睡蓮花(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾。

1.1.2試劑。異槲皮苷、紫云英苷、isostrictiniin和煙花苷對照品由該研究室自制，含量均大于95%。D101大孔吸附樹脂購自天津興南允能高分子技術有限公司；聚酰胺樹脂購自浙江臺州四甲生化材料廠；乙腈、甲醇為色譜純，乙醇等其他試劑為國產分析純。

1.1.3儀器。TBE-300B高速逆流色譜儀由上海同田生化技術有限公司生產；N2000色譜工作站由浙江大學智達信息工程有限公司生產；SPD-10Avp高效液相色譜儀由日本島津公司生產；AS系列超聲波清洗機由天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產。

1.2方法

1.2.1睡蓮花提取物的制備。睡蓮花藥材脫脂后，以料液比1∶25(g/mL)加入70%乙醇，回流提取3次，每次提取0.5 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮至浸膏。然后將睡蓮花提取物浸膏以適量蒸餾水溶解后上D101大孔樹脂，先分別用5倍柱體積的水和30%乙醇除雜，再以50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。浸膏以水混懸溶解后上聚酰胺吸附樹脂，先以5倍柱體積水除雜，再用60%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥備用。

1.2.2HSCCC溶劑體系的確定。選擇乙酸乙酯∶水(5∶5)、乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)、乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶乙醇∶水(4∶1∶5)作為進行HSCCC的溶劑體系。各溶劑體系配制后充分振搖，然后靜置分層，分別取上、下相溶劑各3.0 mL，置于裝有5 mg樣品的具塞試管中，充分振搖溶解后靜置分層，分別取上下相溶液以HPLC檢測，計算分配系數(shù)K，K=A1/A2(A1和A2分別為上相和下相各色譜峰的峰面積)。

1.2.3HSCCC法分離純化睡蓮花提取物中的有效成分。試驗前將達到平衡的兩相溶劑系統(tǒng)按上相和下相分別放入試劑瓶中，超聲脫氣20 min。將上相(固定相)以10 mL/min的速度泵入HSCCC螺旋管中，待螺旋管充滿后，緩慢調節(jié)主機轉數(shù)至850 r/min，同時以2.0 mL/min的速度將下相(流動相)泵入其中，待兩相平衡后取樣品200 mg溶于上下相各5 mL的混合溶液中，由進樣閥注入到螺旋管中，同時開始采集數(shù)據(jù)。

1.2.4HPLC檢測分析。采用HPLC檢測各色譜峰的純度。色譜條件：Phenomenex C18柱(250×4.6，5 μm)，梯度洗脫程序(0 min～15 min～20 min，21%A～25%A～21%A)；流動相為乙腈(A)∶0.2%磷酸水溶液(B)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。

2　結果與分析

2.1HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇溶劑系統(tǒng)的選擇是通過目標成分的分配系數(shù)K、分離度等因素決定的，目標成分在不同溶劑體系中的K值見表1。在4種溶劑系統(tǒng)中，各化合物的K值差異較大，能夠保證各化合物間具有較好的分離度。然而，在溶劑系統(tǒng)①和③中，化合物I和II的K值太大，分離時間長，效率低。乙酸乙酯-甲醇-水(4∶1∶5，②)和乙酸乙酯-乙醇-水(4∶1∶5，④)系統(tǒng)有合適的K值，對分離純化睡蓮花酚類成分較為合適，然而溶劑系統(tǒng)④在HSCCC上的保留率低，故選擇乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)系統(tǒng)進行睡蓮花酚類成分的分離，分別得到組分I( 41.4 mg)、II(40 mg)以及III和IV的混合物(85 mg)。溶劑系統(tǒng)③對化合物III和IV有較好的分離度，進一步選擇該體系從該混合物中分離純化得到化合物III(50.1 mg)和IV(26.3 mg)。該體系分離效果好，固定相保留率43.1%。HSCCC分離純化效果見圖2。

表1　睡蓮花酚類成分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)

注：a.乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)；b.乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)。Note: a.Ethyl acetate ∶ methanol ∶ water(4∶1∶5);b. Ethyl acetate ∶ n-butanol ∶ water (4∶1∶5).圖2　睡蓮花酚類成分的高速逆流色譜Fig.2　HSCCC chromatogram of phenolic compounds from N.candida

2.2HPLC純度檢測及結構確證經HPLC分析，化合物I、II～IV的純度分別為73.53%、92.42%、82.36%和85.65%。通過波譜技術及理化性質，并與已知對照品共薄層，Rf值一致，故確證它們的結構分別為異槲皮苷(I)、紫云英苷(II)、isostrictiniin(III)和煙花苷(IV)。

注：I .異槲皮苷，II.紫云英苷，III.isostrictiniin，IV.煙花苷。Note：I.Isoquercitrin；II.Astragalin；III.Isostrictiniin；IV.Nicotiflorin.圖3　睡蓮花酚類成分的HPLC色譜圖Fig.3　HPLC chromatogram of phenolic compounds from N.candida

3　結論

利用HSCCC方法對雪白睡蓮花提取物中的標識性酚類化合物進行了分離純化，經過溶劑體系的優(yōu)化選擇，應用乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)兩步從雪白睡蓮花提取物中分離得到了異槲皮苷、紫云英苷、isostrictiniin和煙花苷。該方法樣品損失小，且能夠快速從睡蓮花中獲得高純度的標示性成分。試驗結果可為維吾爾藥睡蓮花質量標準的制定及其進一步深入開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部中國藥典委員會.維吾爾藥分冊[S].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：41.

[2] 劉勇民.維吾爾藥志：下[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：541.

[3] RAJAGOPAL K，SASIKALA K，RAGAVAN B.Hypoglycemic and antihyperglycemic activity ofNymphaeastellataflowers in normal and alloxan diabetic rats [J].Pharm Biol，2008，46：654-659.

[4] ZHAO J，LIU T，MA L，et al.Antioxidant and preventive effects of extract fromNymphaeacandidaflower oninvitroimmunological liver injury of rat primary hepatocyte cultures [J/OL].Evidence-based complementary and alternative medicine(2009-01-12)[2016-04-05].http：//www.doc88.com/p-3347741121785.html.doi:101093/ecam/nep003.

[5] RAJAGOPAL K，SASIKALA K，RAGAVAN B.Hypoglycemic and antihyperglycemic activity ofNymphaeastellataflowers in normal and alloxan diabetic rats[J].Pharm Biol，2008，46：654-659.

[6] 趙軍，徐芳，吉騰飛，等.睡蓮屬植物化學成分及生物活性研究進展[J].天然產物研究與開發(fā)，2014，26(1)：141-147.

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Isolation and Purification of Phenolic Compounds fromNymphaeacandidaPresl by High-speed Counter-current Chromatography

ABUDUREYIMU Maiwylajiang1, LI Chen-yang2, LI Qian1, ZHAO Jun2*et al

(1. College of Life Sciences & Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046; 2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines, Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi, Xinjiang 830004)

[Objective] To isolate and purify phenolic constituents fromNymphaeacandidaPresl by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). [Methods] HSCCC was employed to separate phenolic compounds fromN.candidawith two steps. Two solvent systems were ethyl acetate ∶ methanol ∶ water (4∶1∶5) and ethyl acetate ∶ n-butanol ∶ water (4∶1∶5). HSCCC was executed under the conditions of 2.0 mL/min flow rate, 850 r/min rotation speed and 254 nm detection wavelength. The purities of compounds were determined by HPLC. [Result] In the first separation step, isoquercitrin (I, 41.4 mg), astragalin (II, 40 mg) and mixtures of III and IV (85 mg) were extracted from 200 mg sample. In the second step, mixtures of III and IV were obtained: isostrictiniin (III, 50.1 mg) and nicotiflorin(IV, 26.3 mg). The purities of these compounds were determined as 73.53%, 92.42%, 82.36% and 85.65% by HPLC. [Conclusion] Phenolic compounds fromN.candidacan be quickly isolated and purified by HSCCC.

High-speed counter-current chromatography;Nymphaeacandida; Phenolic compounds

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計劃項目(20133318)。

買吾拉江·阿不都熱衣木(1992- )，男，新疆柯坪人，碩士研究生，研究方向：藥食兼用植物的研究與開發(fā)。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導師，從事藥食兼用植物的研究與開發(fā)工作。

2016-06-06

S 567.2

A

0517-6611(2016)21-107-03