張　佳,　張曉歌,　張　璨,　張國珍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點實驗室, 北京　100193)

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北京地區(qū)草莓灰霉病菌的轉(zhuǎn)座子及其分布頻率

張佳,張曉歌,張璨,張國珍*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點實驗室, 北京100193)

為了解北京地區(qū)草莓灰霉病菌的轉(zhuǎn)座子類型及其分布,本研究用轉(zhuǎn)座子Boty和Flipper的特異性引物對北京地區(qū)2012-2013年從12個草莓園采集和分離的60株草莓灰霉病菌進行PCR擴增。結(jié)果表明,北京地區(qū)草莓灰霉病菌群體中共存在3種轉(zhuǎn)座子類型:transposa型、Boty型和Flipper型。其中,以transposa型菌株最多,占供試菌株的63.3%,Boty型菌株占供試菌株的28.3%,Flipper型菌株最少,僅占8.4%,未檢測到vacuma型菌株。選取屬于不同轉(zhuǎn)座子類型的18株菌株測定其對草莓葉片的致病力,結(jié)果顯示Boty型菌株所致病斑的平均直徑顯著大于Flipper型。草莓灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型與致病力的關(guān)系有待進一步研究。轉(zhuǎn)座子類型的檢測為進一步研究灰葡萄孢的遺傳多樣性及遺傳變異提供了基礎(chǔ)。

草莓;灰葡萄孢;轉(zhuǎn)座子;Boty;Flipper

(The Key Laboratory of Plant Pathology, Ministry of Agriculture; Department of Plant Pathology,China Agricultural University, Beijing100193, China)

灰霉病是草莓上的重要病害,主要發(fā)生在采果期。染病的果實在采摘后通常迅速腐爛,不能食用和出售,造成嚴重損失[1]?；颐共〉牟≡移咸焰?BotrytiscinereaPers.)能侵染200種以上的植物,其中以雙子葉植物居多,可導(dǎo)致寄主植物毀滅性損失[2]。

轉(zhuǎn)座子是一類可移動的遺傳因子,其DNA片段可以從原位上單獨復(fù)制或斷裂下來,環(huán)化后插入另一位點,并對其后的基因起調(diào)控作用。轉(zhuǎn)座子可以用于研究絲狀真菌群體多樣性,主要是因為轉(zhuǎn)座子是一種不依賴同源重組而能在基因組內(nèi)移動的遺傳學(xué)元件,其廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中,且在真菌基因組中的分布、插入位置、拷貝數(shù)不同,從而在菌株間或群體內(nèi)導(dǎo)致多樣性[3]。在灰葡萄孢中有2種轉(zhuǎn)座子Boty和Flipper。轉(zhuǎn)座子的有無與灰葡萄孢的多樣性存在一定的聯(lián)系[3-4],主要是這兩種轉(zhuǎn)座子的存在與否可影響灰葡萄孢菌株的分生孢子大小、生長速率、致病性以及對殺菌劑的抗性[5]。Boty是一個具有多重拷貝,分散在灰葡萄孢整個基因組中的單元,它包含596 bp的長末端重復(fù)序列[6]。Flipper是硝酸鹽還原酶基因編碼區(qū)的一段插入序列,長度為1 842 bp,可能編碼一種轉(zhuǎn)座酶。Flipper在灰葡萄孢基因組中的數(shù)量從0到20個拷貝數(shù)不等[7]。

早在1997年,Giraud等[5]根據(jù)灰葡萄孢菌株基因組中是否存在轉(zhuǎn)座子Boty和Flipper,將來自法國香檳產(chǎn)區(qū)葡萄上的灰葡萄孢分為2類,即transposa型(同時含有Boty和Flipper轉(zhuǎn)座子)和vacuma型(不含有Boty和Flipper中的任一種轉(zhuǎn)座子),另外也有部分菌株只含有Boty轉(zhuǎn)座子。在隨后的十幾年中,美國、匈牙利、希臘等國相繼報道了本國灰葡萄孢的轉(zhuǎn)座子類型。目前,根據(jù)轉(zhuǎn)座子Boty和Flipper的有無,一般將灰葡萄孢分為4種類型,即transposa型、Boty型(只有轉(zhuǎn)座子Boty)、Flipper型(只有轉(zhuǎn)座子Flipper)和vacuma型,且各類型的菌株所占比例也不同,其中在美國[8]和匈牙利[9],transposa型的菌株分別占群體的83.3%和67.9%,而其余3種類型的菌株比率較少;在希臘,葡萄、草莓、番茄和黃瓜上的灰葡萄孢,以transposa型的菌株占優(yōu)勢,其中草莓的灰葡萄孢中transposa型占50%以上;而獼猴桃和蘋果上的灰葡萄孢,以vacuma型占優(yōu)勢[10]。

我國對灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型的研究很少。張靜[11]檢測了湖北省100株來自不同寄主灰葡萄孢的轉(zhuǎn)座子,發(fā)現(xiàn)共存在4種類型的菌株:transposa型、Boty型、Flipper型和vacuma型,比率分別為62%、11%、23%和4%。黃燕等[12]從國內(nèi)6省13個縣市的蠶豆病株上分離了100株灰葡萄孢,發(fā)現(xiàn)可分為3類:transposa型、Boty型和Flipper型,其中Boty型菌株最多,占檢測群體的61.0%。目前尚未見國內(nèi)關(guān)于草莓灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型的報道。

近年來,北京地區(qū)大力發(fā)展設(shè)施草莓種植模式,主要為日光溫室栽培,且種植面積持續(xù)增長。設(shè)施栽培也為灰霉病的發(fā)生提供了有利條件。據(jù)我們觀察,草莓灰霉病菌不同菌株在菌落形態(tài)、菌核特征和致病性等方面表現(xiàn)多樣性,對殺菌劑異菌脲的抗性也存在差異[13]。本研究重點檢測了2012-2013年從北京地區(qū)12個草莓園采集的草莓灰霉病菌的轉(zhuǎn)座子類型,初步分析了不同菌株的轉(zhuǎn)座子類型與致病力的關(guān)系,旨在為研究我國灰葡萄孢的遺傳多樣性及遺傳變異機制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

草莓灰霉病病菌(Botrytiscinerea):2012年和2013年從北京市5個區(qū)縣的12個草莓種植園采集草莓灰霉病病果,帶回實驗室進行分離培養(yǎng)和純化,每個病果只保留1個單孢菌株,共獲得60株,其中2012年18株,2013年42株(表1)。

表1　2012-2013年北京地區(qū)采集的草莓 灰霉病菌菌株信息Table 1　Tested isolates of Botrytis cinerea collected from 12 strawberry gardens in Beijing from 2012 to 2013

續(xù)表1Table 1(Continued)

采集區(qū)縣Collectingdistrict菌株編號Isolatenumber采集地點Collectingsite采集年份Year轉(zhuǎn)座子類型Transposontype通州區(qū)TongzhouRZY1瑞正園2013transposaRZY2瑞正園2013FlipperRZY3瑞正園2013transposaRZY4瑞正園2013transposaRZY5瑞正園2013Flipper海淀區(qū)HaidianBJ17北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013transposaBJ18北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013FlipperBJ19北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013transposaLGS1北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013transposaLGS2北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013transposaLGS3北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013transposaLGS4北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013FlipperLGS5北京農(nóng)林科學(xué)院林果所2013transposaSJT1蘇家坨2013FlipperSJT2蘇家坨2013transposaSJT3蘇家坨2013transposaBJ20一品香山草莓園2012transposaBJ21一品香山草莓園2012transposaBJ22一品香山草莓園2012transposa房山區(qū)FangshanBJ1夏場2012transposaBJ8夏場2012transposaBJ10夏場2012FlipperBJ11夏場2012transposaFS1夏場2013FlipperFS2夏場2013FlipperFS3夏場2013transposaFS4夏場2013transposaFS5夏場2013transposaFS6夏場2013BotyFS7夏場2013transposaFS8夏場2013transposaBJ2韓村河2012transposaBJ3韓村河2012transposaBJ4韓村河2012transposaBJ5韓村河2012transposaBJ6韓村河2012transposaBJ7韓村河2012transposa大興區(qū)DaxingQYD青云店2013Boty總計Total60

1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 mL。

1.3基因組DNA的提取

將分離純化的菌株在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上20℃黑暗培養(yǎng)3 d,收集菌絲體,采用 CTAB法[14]提取菌絲體DNA。

1.4草莓灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型的檢測

在灰葡萄孢中,檢測轉(zhuǎn)座子Boty的PCR引物為LTR98(5′-AGCCTGTAGAATCACCAACG-3′)和LTR728(5′-CGGTATTTCTGGTTGGCA-3′),擴增產(chǎn)物大小為648 bp[15]。檢測轉(zhuǎn)座子Flipper的PCR引物為F300(5′-GCACAAAACCTACAGAAGA-3′)和F1500(5′-ATTCGTTTCTTGGACTGTA-3′),擴增產(chǎn)物大小為1 250 bp[8]。

PCR反應(yīng)體系為25 μL:2×TaqPCR Mix(Aidlab)12.5 μL,10 μmol/L上下游引物各1 μL,模板50 ng。

轉(zhuǎn)座子Boty的PCR擴增程序為[15]:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性40 s,60.3℃退火40 s,72℃延伸1 min(40個循環(huán)); 72℃延伸10 min。

轉(zhuǎn)座子Flipper的PCR擴增程序為[8]:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性40 s,58℃退火40 s,72℃延伸1.5 min(40個循環(huán)); 72℃延伸10 min。

取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像儀下觀察擴增結(jié)果,并照相。

1.5致病力的測定

從不同類型轉(zhuǎn)座子的菌株中隨機選取18株(transposa型9株;Flipper型6株;Boty型3株)進行致病力測定。采用草莓離體葉片有傷接種,草莓品種為‘紅顏’。菌株在PDA培養(yǎng)基上20℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d,用滅菌的直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅。用無菌昆蟲針將草莓葉表面輕輕刺傷,將菌餅的菌絲面朝下接種于傷口處。以PDA培養(yǎng)基為對照,每株菌株重復(fù)接種3個葉片,每個葉片接種2個菌餅。將接種后的葉片置于20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng),72 h后用十字交叉法測量病斑直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1草莓灰霉病菌的轉(zhuǎn)座子類型

用轉(zhuǎn)座子Boty和Flipper的特異性引物對供試菌株的基因組DNA進行PCR擴增后,得到的Boty片段長度為648 bp,Flipper片段長度為1 250 bp(圖1)。

圖1　灰葡萄孢轉(zhuǎn)座子PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測Fig.1　Electrophoresis of PCR amplicon of Botrytis cinerea transposon genotype

根據(jù)PCR擴增結(jié)果,北京地區(qū)草莓灰霉病菌共存在3種轉(zhuǎn)座子類型:transposa型(同時含有Flipper和Boty)、Boty型(只有Boty)和Flipper型(只有Flipper)。

2.2不同轉(zhuǎn)座子類型的草莓灰霉病菌所占的比率

對60個灰霉病菌菌株轉(zhuǎn)座子的PCR擴增結(jié)果表明，transposa型菌株共38株,占供試菌株的63.3%,Flipper型菌株17株,占供試菌株的28.3%,Boty型菌株5株,占8.4%,未發(fā)現(xiàn)vacuma型的菌株(圖2)。

圖2　含有不同轉(zhuǎn)座子的草莓灰霉病菌菌株所占百分率Fig.2　Percentage of Botrytis cinerea isolates carrying different transposons

2.3北京五區(qū)縣不同轉(zhuǎn)座子類型草莓灰霉病菌的分布比例

分析北京市5個區(qū)草莓灰霉病菌的轉(zhuǎn)座子類型及其所占比例,發(fā)現(xiàn)與北京地區(qū)總體情況一致,即在昌平、通州、海淀和房山區(qū)均為transposa型的菌株最多,Flipper型次之,Boty型所占比率最少,但各區(qū)菌株的轉(zhuǎn)座子類型也有一定差異,通州區(qū)和海淀區(qū)共19株,均有2種類型,即transposa型和Flipper型,未發(fā)現(xiàn)有Boty型,昌平區(qū)和房山區(qū)共40株,均有3種類型,即transposa、Flipper和Boty,大興區(qū)因為只有1株,為一種類型,即Boty型(圖3,表1)。

圖3　北京市5個區(qū)縣不同轉(zhuǎn)座子類型的 草莓灰霉病菌菌株所占百分率Fig.3　Proportion of Botrytis cinerea isolates carrying different transposons from 5 districts in Beijing

2.4不同轉(zhuǎn)座子類型的菌株對草莓葉片的致病力

選取的18株菌株對草莓葉片均有致病性。不同菌株的致病力有差異,病斑直徑在13.0～26.8 mm之間。比較不同轉(zhuǎn)座子類型菌株所致病斑大小,發(fā)現(xiàn)Boty型菌株引起的病斑直徑顯著大于transposa型菌株,也大于Flipper型菌株,但差異不顯著(表2)。

表2　不同轉(zhuǎn)座子類型的灰葡萄孢菌株的致病力比較1)Table 2　Comparison of pathogenicity of Botrytis cinereaisolates carrying different transposons

1) 根據(jù)Duncan分析,同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示數(shù)據(jù)間無顯著性差異(α=0.05)。

According to Duncan analysis, data followed by the same letters in the same column mean no significant difference at 0.05 level.

3　小結(jié)與討論

本研究對采自北京市5個區(qū)縣的60株草莓灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型進行檢測,共發(fā)現(xiàn)3種轉(zhuǎn)座子類型,transposa、Boty和Flipper,且transposa型的菌株所占比例最多,達63.3%。這與湖北省不同寄主上的灰葡萄孢菌株以transposa型最多的報道一致[10],但本研究中,Boty型菌株的比率高于湖北省,而Flipper類型的菌株比率低于湖北省,沒有檢測到vacuma型。其他一些國家關(guān)于灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型的報道中,transposa型菌株的比率均占到了群體的65%以上。例如,在美國加利福尼亞地區(qū)來自無花果、葡萄、獼猴桃、豌豆和南瓜上的234株灰葡萄孢中,transposa型菌株占83.3%[8];匈牙利的109株灰葡萄孢中,transposa型菌株占67.9%,vacuma型菌株占9.2%,其余菌株為Boty型或Flipper型[9]。德國的209株灰葡萄孢中,transposa型、vacuma型和Boty型菌株所占百分比分別為62.7%、14.4%和23.5%[16]。在智利,葡萄上的457株灰葡萄孢中,transposa型菌株占絕大多數(shù),其次是Boty型,vacuma型菌株較少,沒有發(fā)現(xiàn)Flipper型[17]。

本研究對北京市昌平、通州、海淀、房山和大興5個區(qū)草莓上的灰葡萄孢菌株轉(zhuǎn)座子類型進行了檢測和分析,發(fā)現(xiàn)除大興區(qū)只采到1個菌株外,其他4個區(qū)的優(yōu)勢轉(zhuǎn)座子類型與北京總體情況一致,但各區(qū)之間又略有差異,昌平區(qū)和房山區(qū)的菌株有3種轉(zhuǎn)座子類型,通州區(qū)和海淀區(qū)只有transposa型和Flipper型,未發(fā)現(xiàn)有Boty型。根據(jù)黃燕等[12]的研究結(jié)果,灰葡萄孢轉(zhuǎn)座子基因型分布有明顯的地域性,如江蘇的菌株為Flipper型,重慶、四川、甘肅和河北的菌株為Boty型,而青海的菌株為transposa型?？梢?國內(nèi)的灰霉病菌中vacuma型菌株所占比例較少[11]或不存在[12]。本研究在北京市5個區(qū)的草莓灰霉病菌中未發(fā)現(xiàn)vacuma型菌株,其他省市的草莓灰霉病菌是否存在vacuma型還有待進一步檢測。

對北京市草莓灰霉病菌轉(zhuǎn)座子類型與致病力分析發(fā)現(xiàn),transposa型菌株對草莓的致病力較弱,而Boty型菌株致病力較強。草莓灰霉病菌的轉(zhuǎn)座子類型與致病力是否存在必然聯(lián)系,還有待進一步擴大菌株數(shù)量進行驗證和研究。

在群體遺傳學(xué)研究中,轉(zhuǎn)座子的出現(xiàn)被認為是發(fā)生重組的間接證明;同時,轉(zhuǎn)座子還為追蹤群體的變化提供了途徑,這將有助于分析一段時間內(nèi)的種群動態(tài)[18]。另外,轉(zhuǎn)座子是一類跳躍性的元件,可以插入到基因組的某一位點,從而在真菌基因組中的分布、插入位置、拷貝數(shù)不同[11],因此它還是研究絲狀真菌群體多樣性的有力工具。Martinez等[3]發(fā)現(xiàn)法國葡萄上灰葡萄孢vacuma型菌株的生長速率明顯快于transposa型菌株。據(jù)我們的觀察,同是來自草莓的灰葡萄孢在菌落生長速度、菌核的大小和產(chǎn)量、致病力及抗藥性等多個方面均存在差異,表現(xiàn)出多樣性(本實驗室未發(fā)表結(jié)果),這些差異是否與轉(zhuǎn)座子有關(guān)還需要進一步研究。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Presence and frequency distribution of transposable elements in

Botrytiscinereafrom strawberry in Beijing

Zhang Jia,Zhang Xiaoge,Zhang Can,Zhang Guozhen

This study was conducted primarily to investigate the presence and frequency distribution of the transposable elements Boty and Flipper in populations ofBotrytiscinereafrom 12 strawberry gardens in Beijing. A total of 60 isolates were collected from diseased strawberry fruits during 2012-2013, and the presence of transposable elements was analyzed by specific PCR. The results showed that there were three types (transposa,BotyandFlipper) of transposable elements. Thetransposatype isolates carrying both elements were predominant with frequency of 63.3%, and bothBotytype andFlippertype isolates were present with low frequencies of 28.3% and 8.4%, respectively, whilevacumatype isolate was not detected in this study. The pathogenicity analysis of 18 isolates selected from three types demonstrated thatBotytype isolates showed the highest pathogenicity to strawberry leaves, with the larger lesion size thanFlippertype andtransposatype isolates. The relationship between transposon types and pathogenicity ofB.cinereais needed to study. Detection of transposable elements provides the bases for further study of genetic diversity and variation inB.cinerea.

strawberry;Botrytiscinerea;transposon;Boty;Flipper

2015-01-30

2015-02-14

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303025)；北京市教委-科學(xué)研究與研究生培養(yǎng)共建項目(201502911110426)

E-mail: zhanggzh@cau.edu.cn

S 436.63

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.032